一种用于合成丙酮酸或L-酪氨酸的菌株

本发明属于生物工程，具体涉及一种用于合成丙酮酸或l-酪氨酸的菌株。

背景技术：

1、丙酮酸是糖酵解途径中的关键中间体，是一种广泛用于不同行业的重要平台化合物。丙酮酸的传统合成方法主要包括酒石酸脱水脱羧法和乳酸氧化法，但因成本较高，很难大规模应用。随着生物工程的发展，微生物发酵法展现巨大的应用潜力。微生物发酵法中，最常用的策略是将丙酮酸的下游途径进行阻断以积累丙酮酸，比如敲除基因acee，其表达丙酮酸脱羧酶复合物的e1组分(n.maleki,m.safari,m.a.eiteman,conversion ofglucose-xylose mixtures to pyruvate using a consortium of metabolicallyengineered escherichia coli.eng.life sci.18,40-47(2017)；b.zhang,y.zhu,j.zhang,d.wang,l.sun,j.hong,engineered kluyveromyces marxianus for pyruvateproduction at elevated temperature with simultaneous consumption of xyloseand glucose.bioresour.technol.224,553-562(2017))。但该种策略通常需要额外补充营养物质以平衡生长，比如添加乙酸盐或者酵母膏。

2、本发明通过基因工程手段改造大肠杆菌，将crispri体系引入大肠杆菌，不需要额外关注菌株的生长，菌株本身便可以平衡生长以及丙酮酸积累。

3、l-酪氨酸是一种重要的营养必需氨基酸，广泛应用在食品、饲料、医药和化工等行业。其常作为苯丙酮尿症患者的营养补充剂，以及多肽类激素、抗生素、l-多巴、黑色素、对羟基肉桂酸、对羟基苯乙烯等医药化工产品的制备原料。l-酪氨酸早期主要依靠蛋白水解法，但该方法存在着诸多限制，比如周期长和材料来源有限等，已经被淘汰。目前最为流行的是酶法以及微生物发酵法。酶法主要是利用微生物来源的酪氨酸酚裂解酶tpl，将苯酚、氨和丙酮酸或者苯酚、l-丝氨酸转化为l-酪氨酸。但丙酮酸或者l-丝氨酸并不是可再生的资源，并且生产过程中涉及全细胞或者酶的制备，无疑又增加了生产成本。微生物发酵法一直是人们追求的热点，但l-酪氨酸合成途径复杂，涉及多种关键的酶，往往造成较低的转化效率。

4、本发明将微生物发酵与酶的催化相结合，提供了一条新的具有潜力的l-酪氨酸合成策略。

技术实现思路

1、本发明的目的是针对现有技术中存在的问题，提供一种用于合成丙酮酸或l-酪氨酸的菌株。

2、本发明通过基因工程手段改造大肠杆菌，不仅可以将葡萄糖、木糖或者葡萄糖-木糖混合物转化为丙酮酸，还可以将木质素衍生的酚类化合物(苯酚和对香豆酸)与葡萄糖、木糖或者葡萄糖和木糖混合物转化为l-酪氨酸。丙酮酸的产量在2-35g/l，l-酪氨酸的产量在1-21g/l。

3、本发明的目的可以通过以下方案来实现：

4、本发明提供了一种用于合成丙酮酸的基因工程菌，是通过在大肠杆菌中引入crispr/dcas9干扰系统crispri，抑制丙酮酸脱羧酶复合物e1基因acee的表达构建而得的菌株，记为菌株spyr；所述crispri由dcas9蛋白和向导rna组成，所述向导rna为序列如seqid no.01-seq id no.14中任意一条所示的向导rna。

5、所述大肠杆菌为敲除了ptsg基因、manz基因、galp基因以及glk基因的大肠杆菌；引入的crispri由dcas9蛋白和向导rna组成，所述向导rna为序列如seq id no.13所示的向导rna。

6、所述用于合成丙酮酸的基因工程菌，通过如下构建方法得到：

7、(1)ps2k-dcas9的构建

8、将dcas9基因通过酶切连接进入载体ps2k中，得到质粒ps2k-dcas9；

9、(2)ptargetf-acee 01-14构建

10、将序列依次如seq id no.01-seq id no.14所示的向导rna01-14分别连接到质粒ptargetf上，分别获得质粒ptargetf-acee 01-14；

11、(3)菌株spyr01-15构建

12、菌株spyr01-14：将质粒ps2k-dcas9分别和ptargetf-acee 01-14转化进入e.colimg1655中，获得菌株，分别记为菌株spyr01-14；

13、菌株spyr15：将质粒ps2k-dcas9和ptargetf-acee 13转化进入e.coli mg74a3中，获得菌株，记为菌株spyr15。

14、步骤(1)中，dcas9基因为来源于streptococcus pyogenes的cas9基因，失去核酸酶活性得到的基因。

15、步骤(2)中，向导rna01-14表示14条向导rna，具体如下：

16、向导rna 01的序列如seq id no.01所示：cgaagcgcgtactttcggta；

17、向导rna 02的序列如seq id no.02所示：ggatgaccgattcgatcgcc；

18、向导rna 03的序列如seq id no.03所示：ctttccggcgagagttcaat；

19、向导rna 04的序列如seq id no.04所示：tcaacgttattagatagata；

20、向导rna 05的序列如seq id no.05所示：tgcgggcttcagcaagcagt；

21、向导rna 06的序列如seq id no.06所示：gttgctgatacctgtgcctg；

22、向导rna 07的序列如seq id no.07所示：agcggatagctgaacgaata；

23、向导rna 08的序列如seq id no.08所示：aatggttgcggaagactgga；

24、向导rna 09的序列如seq id no.09所示：ggcgacctggtttacttcca；

25、向导rna 10的序列如seq id no.10所示：ccagacccatagatacggtc；

26、向导rna11的序列如seq id no.11所示：ccgggccgtcaagacgctgc；

27、向导rna 12的序列如seq id no.12所示：tcgatatctgcatcagacac；

28、向导rna 13的序列如seq id no.13所示：tcttcggatcgtgaccacca；

29、向导rna 14的序列如seq id no.14所示：gcgccgaagtcttgcaggct。

30、步骤(2)中得到的质粒ptargetf-acee 01-14分别为ptargetf-acee 01、ptargetf-acee02、ptargetf-acee 03、ptargetf-acee 04、ptargetf-acee 05、ptargetf-acee 06、ptargetf-acee07、ptargetf-acee 08、ptargetf-acee 09、ptargetf-acee 10、ptargetf-acee 11、ptargetf-acee12、ptargetf-acee 13、ptargetf-acee 14。

31、步骤(3)中，e.coli mg74a3是通过敲除e.coli mg1655中的ptsg基因(负责编码磷酸转移酶系统的葡萄糖特异性酶iicb组分)、manz基因(编码磷酸转移酶系统的甘露糖特异性酶iid组分)、galp基因(编码半乳糖转移酶)以及glk基因(编码葡萄糖激酶)获得的。得到的e.coli mg1655(mg74a3)只代谢木糖不代谢葡萄糖。

32、本发明主要是通过在大肠杆菌中引入crispr/dcas9干扰系统(crispri)，抑制丙酮酸脱羧酶复合物e1基因acee的表达来实现的，其中，crispri由dcas9蛋白和可设计的向导rna(向导rna 01-14)组成。

33、构建方法中的酶切的酶是bsai酶，是通过golden-gate无缝克隆方法实现。

34、本发明还提供了一种所述基因工程菌合成丙酮酸的方法，包括如下步骤：

35、将基因工程菌接种到基础盐培养基中，待od600达到0.6-0.8时，加入诱导剂后发酵，即得丙酮酸。

36、所述基因工程菌为菌株spyr01-14中的一株时，是通过代谢葡萄糖合成丙酮酸，基础盐培养基中葡萄糖的起始浓度10-25g/l；

37、所述基因工程菌为菌株spyr15时，是通过代谢木糖合成丙酮酸，基础盐培养基中木糖的起始浓度6.5-15g/l。

38、合成方法中，基因工程菌的接种比例为3-5％。诱导剂为脱水四环素(atc)，加入后的终浓度为0.25-0.35mg/l。发酵时间为12-36h(发酵时间指加入诱导剂至发酵结束)。

39、所述基础盐培养基为改善的m9培养基，包括如下各组分：kh2po4 1-3g/l，na2hpo44-7g/l，nacl 0.5-1g/l，(nh4)2so4 4-7g/l，mgso4·7h2o 0.4-0.6g/l，cacl2·2h2o0.4-0.6mg/l，fecl3·6h2o 0.6-0.8mg/l，mncl2·4h2o 0.1-0.2mg/l，zncl2 0.1-0.2mg/l，cucl2·2h2o 0.04-0.05mg/l，cocl2·6h2o 0.05-0.08mg/l，na2moo4·2h2o 0.05-0.07mg/l，thiamin·hcl 0.8-1.2mg/l。所述培养基成分皆可通过在国药、生工等正规试剂公司购买得到。

40、本发明提供了一种用于合成丙酮酸的菌群的构建方法，包括如下步骤：将菌株spyr01-14中的一株，与spyr15接种到基础盐培养基中即可；菌株spyr01-14和spyr15的接种比例分别为0.5-0.75％和3-5％。本发明的spyr15可以和spyr01-14的任意一株菌进行组合构建代谢葡萄-木糖的菌群。其中，最优的合成丙酮酸的大肠杆菌菌群是由spyr13与spyr15所构建，即spyr13-spyr15。

41、本发明还提供了一种所述菌群合成丙酮酸的方法，包括如下步骤：

42、所述菌群以葡萄糖-木糖为底物发酵得到丙酮酸；所述菌群由所述菌株spyr01-14中的一株，与菌株spyr15组成。

43、方法包括如下步骤：

44、将所述的菌株spyr01-14中的一株，与spyr15接种到基础盐培养基中，加入葡萄糖-木糖混合物，待od600达到1.2-1.5时，加入诱导剂后发酵，得到丙酮酸。

45、葡萄糖的起始浓度为10-15g/l，木糖的起始浓度为5-8g/l。

46、发酵过程中，当葡萄糖和木糖的浓度消耗至0-2g/l范围时，补加葡萄糖-木糖混合物，继续发酵。补加葡萄糖-木糖混合物的次数为2次。第一次加入是在发酵过程中15-17h时加入，加入后的葡萄糖的浓度为10-13g/l，木糖的浓度为4-8g/l；第二次加入是在发酵过程中20-23h时加入，加入后的葡萄糖的浓度为10-13g/l，木糖的浓度为4-8g/l。整个发酵时间为34-38h。本发明的菌群spyr13-spyr15可以代谢葡萄糖-木糖混合物合成丙酮酸，通过分批补料策略，可保证个整个过程中丙酮酸的合成稳步增长。

47、本发明还提供了一种用于合成l-酪氨酸的基因工程菌，是通过在所述的基因工程菌中过表达来源于citrobacter freundii的酪氨酸酚裂解酶tpl，或过表达来源于citrobacter freundii的酪氨酸酚裂解酶tpl和来源于bacillus subtilis的脱羧酶bsdbcd，或过表达来源于pseudomonas putida kt2440的香草醛脱氢酶vdh、阿魏酰辅酶a合成酶fcs和烯酰辅酶a水合酶/醛缩酶ech构建而得。

48、在菌株spyr13中过表达所述酪氨酸酚裂解酶tpl，所得菌株记为菌株sgxp01；所述菌株sgxp01的构建步骤为：将tpl通过酶切连接进入载体pa5a中，得到质粒pa5a-tpl，并将该质粒通过热激转化进入spyr13菌中获得菌株sgxp01。

49、在菌株spyr15中过表达所述酪氨酸酚裂解酶tpl，所得菌株记为菌株sgxp02。所述菌株sgxp02的构建步骤为：将tpl通过酶切连接进入载体pa5a中得到质粒pa5a-tpl，并将该质粒通过热激转化进入spyr15菌中获得菌株sgxp02。

50、在菌株spyr15中过表达所述酪氨酸酚裂解酶tpl和脱羧酶bsdbcd，所得菌株记为菌株sgxp06。所述菌株sgxp06的构建步骤为：将tpl、bsdbcd通过酶切连接进入载体pa5a中，得到质粒pa5a-bsdbcd-tpl，并将该质粒通过热激转化进入spyr15菌中获得菌株sgxp06。

51、在菌株spyr13中过表达所述香草醛脱氢酶vdh、阿魏酰辅酶a合成酶fcs和烯酰辅酶a水合酶/醛缩酶ech，所得菌株记为菌株sgxp09。所述菌株sgxp09的构建步骤为：将vdh、fcs和ech通过酶切连接进入载体pa5a中，得到质粒pa5a-fcs-ech-vdh，并将该质粒通过热激转化进入spyr13菌中获得菌株sgxp09。

52、上述所述fcs、ech、vdh、bsdbcd以及tpl皆可以从公开途径获取。

53、菌株sgxp的构建方法中，酶切是通过golden-gate无缝克隆(bsai酶)方法实现。热激转化的温度为42℃，时间为45秒。

54、本发明还提供了一种所述构建方法得到的菌株sgxp在合成l-酪氨酸中应用。所述菌株用于代谢葡萄糖-木糖混合物和木质素衍生的酚类化合物合成l-酪氨酸，木质素衍生的酚类化合物包括苯酚或者对香豆酸中的任何一种。

55、本发明还提供了一种菌群合成l-酪氨酸的方法，所述菌群以葡萄糖-木糖混合物和木质素衍生的酚类化合物为底物发酵得到l-酪氨酸；所述菌群由所述的基因工程菌中的两株组成；所述木质素衍生的酚类化合物包括苯酚、对香豆酸中的任何一种。

56、菌株sgxp01、sgxp02构建成菌群，记为菌群sgxp01-sgxp02，以葡萄糖-木糖混合物和苯酚为底物发酵得到l-酪氨酸；菌株sgxp06、sgxp09构建成菌群，记为菌群sgxp06-sgxp09，以葡萄糖-木糖混合物和对羟基肉桂酸为底物发酵得到l-酪氨酸。

57、合成l-酪氨酸的方法，包括如下步骤：

58、将菌株培养后接种到基础盐培养基中，加入葡萄糖-木糖混合物，待od600达到1.2-1.5时，加入诱导剂、iptg，再加入木质素衍生的酚类化合物，反应结束后即得l-酪氨酸

59、菌群为sgxp01-sgxp02时，sgxp01的接种比例为0.5-0.75％，sgxp02的接种比例为3-5％。加入葡萄糖-木糖混合物时，葡萄糖的起始浓度为10-20g/l，木糖的起始浓度为6-10g/l。木质素衍生的酚类化合物为苯酚，加入的浓度为5-13g/l。

60、菌群为sgxp06-sgxp09时，sgxp06的接种比例为3-5％，sgxp09的接种比例为0.5-0.75％。加入葡萄糖-木糖混合物时，葡萄糖的起始浓度为10-20g/l，木糖的起始浓度为6-10g/l。木质素衍生的酚类化合物为对羟基肉桂酸，加入的浓度为1-2g/l。

61、诱导剂为脱水四环素(atc)，终浓度为0.25-0.35mg/l，iptg的终浓度为0.35-0.5mm。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

62、(1)通过基因工程手段，获得改造的大肠杆菌可以代谢葡萄糖、木糖或者葡萄糖-木糖混合物高效合成丙酮酸，产量在2-35g/l。

63、(2)通过构建微生物菌群，可以转化木质素衍生的酚类化合物和葡萄糖、木糖或者葡萄糖-木糖混合物合成l-酪氨酸，产量在1-21g/l。