一种可用于单细胞测序的高质量玉米根尖细胞核分离方法

本发明涉及生物，特别涉及一种可用于单细胞测序的高质量玉米根尖细胞核分离方法。

背景技术：

1、植物细胞核是细胞的一个重要组成部分，细胞核中包含大部分的遗传物质，即dna。细胞核内的染色体上储存了植物生物体的遗传信息，其中包括控制细胞功能和特征的基因。通过核内基因的表达和调控，细胞核决定了细胞的发育和组织特化。

2、单细胞测序是一种可以获得单个细胞全基因组或转录组信息的技术，可用于研究单个细胞的遗传变异、信号传导通路、细胞类型和发育状态等。单细胞基因组学为研究植物发育和环境响应提供了前所未有的潜力。制备高质量的单细胞核悬液对于单细胞测序起着重要的作用。高质量的单细胞核悬液有助于保持细胞核的完整性和稳定性，提高测序的效率和测序覆盖度，从而有助于获取准确的测序结果。在植物细胞中的高通量研究存在多种限制，例如细胞壁的存在、特定类型细胞分离的操作要求高、缺少稳定遗传的细胞系等。植物单细胞细胞核测序的关键步骤是温和而有效地分离植物细胞核。玉米细胞核无法高效分离使得这些技术应用于玉米等的研究和遗传改良研究相对滞后。

3、现有的细胞核提取分离方法有：

4、1、高速离心法：该方法通过机械碾磨、浸泡和离心的方式，从植物组织中分离出细胞核。首先，将植物组织切碎，并浸泡在细胞破碎缓冲液中，破碎细胞壁。然后，通过高速离心将细胞核沉淀下来。

5、2、梯度离心法：该方法利用不同密度的梯度液体分离细胞核。细胞核提取缓冲液与密度梯度液体层层叠加，在离心过程中，细胞核会在合适密度的液体界面上沉淀下来。

6、这些方法在细胞核提取过程中容易破坏细胞核的完整性，并且不同类型的植物组织所需要的分离条件各不相同。现有的细胞核纯化方案需要在分离细胞核后采用额外的纯化方法来去除细胞碎片和环境rna污染物。这些纯化方法可能需要额外的仪器(比如流式分选)、时间和操作，这可能会影响样本质量。

7、因此，根据具体研究目的和植物材料的特性，探索适用于玉米根尖细胞核的提取和分离方法是十分必要的。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题为如何提取分离得到高质量的玉米根尖细胞核，以解决当前无法获得完整无破裂，背景干净，结团率低，质检结果好的玉米根尖细胞核的技术难题。

2、本发明创新了组织固定液、裂解缓冲液、细胞纯化液和清洗缓冲液中的成分，使用10ml组织研磨器研磨玉米根尖组织，分离得到的细胞核粗提液采用对细胞形态完整性和稳定性没有影响的温和试剂percoll分层液作为细胞核纯化的介质，在适宜的离心条件下得到高质量玉米根尖细胞核悬液，这不仅使玉米根尖细胞核获得了有效的分离，而且可以保持细胞核的稳定性。

3、为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种可用于单细胞测序的高质量玉米根尖细胞核分离方法，包括固定玉米根尖组织后，在组织研磨器中裂解、研磨，过滤、离心后取沉淀物重悬，所得重悬液纯化离心分层得到富集得到的细胞核，重悬清洗后离心获得沉淀即为纯化后的细胞核的步骤；

4、所述固定所用的液体、所述裂解所用的液体、所述重悬所用的液体、所述纯化所用的液体均含有蛋白酶抑制剂；所述纯化所用的液体含有percoll分层液。

5、上述方法中，所述固定所用的液体为组织固定液，所述组织固定液的有效成分为甲醛和蛋白酶抑制剂；

6、所述裂解所用的液体为裂解缓冲液；所述裂解缓冲液的有效成分为tris-hcl缓冲液、氯化钠、氯化镁、吐温-20、牛血清白蛋白、洋地黄皂苷、蛋白酶抑制剂和β-巯基乙醇；

7、所述纯化所用的液体为细胞纯化液；所述细胞纯化液由percoll分层液和稀释缓冲液混合而成；所述稀释缓冲液的有效成分为tris-hcl缓冲液、氯化钠、氯化镁和蛋白酶抑制剂；

8、所述重悬所用液体为清洗缓冲液；所述清洗缓冲液的有效成分为tris-hcl缓冲液、氯化钠、氯化镁、牛血清白蛋白、精胺和蛋白酶抑制剂。

9、上述方法中，所述蛋白酶抑制剂为edta-free蛋白酶抑制剂；

10、所述组织固定液的成分及其浓度如下：体积百分比1％甲醛、1×edta-free蛋白酶抑制剂，其余为无菌水；

11、所述裂解缓冲液的成分及其浓度如下：10mm tris-hcl缓冲液、10mm氯化钠、10mm氯化镁、体积百分比0.2％吐温-20、体积百分比1％牛血清白蛋白、体积百分比0.0075％洋地黄皂苷、1×edta-free蛋白酶抑制剂、体积百分比0.005％β-巯基乙醇，其余为无菌水；所述裂解缓冲液的ph值为7.5；

12、所述细胞纯化液由percoll分层液和稀释缓冲液混合而成；所述稀释缓冲液的成分及其浓度如下：10mm tris-hcl缓冲液、10mm氯化钠、10mm氯化镁、1×edta-free蛋白酶抑制剂，其余为无菌水；所述稀释缓冲液的ph值为7.5；混合得到所述细胞纯化液的所述percoll分层液的体积为所述细胞纯化液体积的60％-70％；

13、所述清洗缓冲液的成分及其浓度如下：10mm tris-hcl缓冲液、10mm氯化钠、10mm氯化镁、体积百分比1％牛血清白蛋白、0.5mm精胺、1×edta-free蛋白酶抑制剂，其余为无菌水；所述清洗缓冲液的ph值为7.5。

14、上述方法中，混合得到所述细胞纯化液的所述percoll分层液的体积最优可为所述细胞纯化液体积的70％。

15、上述方法中，所述根尖组织，为玉米种子萌发至根长9-12cm时的根尖组织。

16、上述方法中，所述根尖组织，横切取玉米根尖后再将其纵切一刀，之后再加入所述组织固定液，目的是增加所述组织固定液和所述根尖组织的接触面积，加强所述根尖组织内部的固定效果。

17、上述方法中，所述固定，在真空条件下的冰上进行。所述固定所用的时长可为50min。所述组织固定液提前在冰上预冷。

18、上述方法中，所述组织研磨器为10ml组织研磨器，该规格的组织研磨器适用于研磨多种组织较大的植物根部组织，以便减少在后续测序中因个体差异引起的数据不可靠问题。

19、本发明分离高质量玉米根尖细胞核的方法，具体可包括如下步骤：

20、a1、将玉米种子萌发出的根尖组织以组织固定液固定，得到固定的根尖组织；

21、a2、将所述固定的根尖组织移至裂解缓冲液中，以组织研磨器研磨，过滤、离心后取沉淀物即为细胞核粗提物；

22、a3、将所述细胞核粗提物以清洗缓冲液重悬得到重悬液，将所述重悬液加至细胞纯化液上面，离心后分层，中间层白色的物质为富集得到的细胞核；

23、a4、取所述中间层白色的物质，以含有蛋白酶抑制剂的清洗缓冲液重悬，离心后所得沉淀即为纯化后的细胞核；

24、所述组织固定液、所述裂解缓冲液、所述细胞纯化液和所述清洗缓冲液均含有蛋白酶抑制剂，抑制蛋白酶活性，保护细胞核完整性。

25、上述方法中，所述a1全部在冰上进行。

26、上述方法中，a2所述离心的条件为：温度4℃，转速100g，离心5min。

27、上述方法中，a3所述离心的条件为：温度4℃，转速1000g，离心15min。

28、上述方法中，a4所述离心的条件为：温度4℃，转速100g，离心5min。

29、本发明还提供所述组织固定液、所述裂解缓冲液、所述细胞纯化液、所述清洗缓冲液及其组合。

30、本发明还提供所述分离高质量玉米根尖细胞核的方法在单细胞测序中的应用。

31、所述应用包含将所述纯化后的细胞核重悬于细胞核缓冲液中，得到用于单细胞测序的细胞核重悬液的步骤。

32、本发明还提供所述组织固定液、所述裂解缓冲液、所述细胞纯化液和所述清洗缓冲液的组合在单细胞测序中的应用。

33、与现有技术相比，本发明的主要有益技术效果是：

34、1、本发明综合考虑了细胞核的特性，在组织固定液、裂解缓冲液、稀释缓冲液和清洗缓冲液中分别加入蛋白酶抑制剂。在单细胞核提取过程中，细胞可能会受到机械或化学处理的影响，可能导致细胞核的破裂或损伤。蛋白酶抑制剂的添加可以帮助维持细胞核的完整性，并减少细胞核的损伤。而且，细胞内存在着许多细胞器和细胞组分，如线粒体、内质网、高尔基体等。这些细胞器和组分可能对单细胞核提取过程中的结果产生干扰。蛋白酶抑制剂可以帮助减少其他细胞组分的降解，从而提高细胞核的纯度。

35、2、本发明使用percoll溶液对研磨过程受损的细胞及其碎片与完整活细胞的分离。根据玉米细胞核大小与密度，发明人使用不同于其他植物根尖细胞核的percoll溶液浓度对玉米根尖细胞核进行分离，获得背景干净的细胞核悬液。

36、3、本发明使用组织研磨器对玉米根尖组织进行充分的研磨，相比于液氮研磨植物组织，使用组织研磨器能降低对细胞的破碎程度，减少碎片的产生，避免样品的损失。相较于使用刀片将植物组织切割成薄片的方法，使用组织研磨器能使组织彻底破碎，细胞核充分释放，避免因为刀片切割过厚造成的组织裂解不充分，降低细胞核的释放率。本发明根据玉米根尖组织的大小选取适用于玉米根尖研磨的组织研磨器，能同时研磨多个玉米根尖组织，减少因植物个体差异带来的数据不可靠问题，此外还可以保证单细胞测序中能捕获到足够的细胞核数。

37、4、本发明使用适用于玉米细胞核密度的离心转速，能提高分离效果，减小临界粒径，提高分离效率，既能增加细胞核提取数量又能保证细胞核的提取纯度。