一种从东方泽泻中提取化合物泽泻生物碱A的方法及其应用

本发明涉及医药，特别是一种从东方泽泻中提取化合物泽泻生物碱a(alismalkaloid a)的方法及其应用。

背景技术：

1、中药泽泻(alismatis rhizoma)为泽泻属(alisma)植物泽泻(alisma planta go-aquatica)或东方泽泻(alisma orientate)的干燥块茎，始载于《神农本草经》，具有利水渗湿、泄热、化浊降脂等功效，广泛应用于中医临床复方药及多种中成药，是国家药品食品监督局认定的保健食品药材。2020版《中国药典》将东方泽泻列为中药泽泻的基源植物，但泽泻的现代药理活性与药效活性成分如何从泽泻中提取出来，是需要进一步研究的技术问题。而中药具有治疗各种疾病的独特之处，特别是疑难杂症，如各种癌症，尤其是肺癌，据who统计，肺癌是目前世界上发病率和死亡率最高的疾病之一，肺癌可分为小细胞肺癌(sclc)和非小细胞肺癌(nsclc)。其中，nsclc是最常见的，占所有肺癌的85％以上，严重威胁人类健康。目前对肺癌的治疗，多是采用手术加化疗，为了减轻化疗药物对人体产生的不良反应，从天然植物中寻找毒性低、疗效高的抗癌活性成分一直是国内外科学工作者研究的重点和热点，研究表明，天然药物中的生物碱成分具有抗肿瘤作用，因此本发明采用人非小细胞肺癌a549和人正常肺上皮细胞beas-2b对从东方泽泻中提取分离出生物碱alismalkaloid a进行抗肺癌活性筛选，实验结果表明alismalkaloid a能显著降低细胞活力与bcl2的表达，诱导a549肺癌细胞凋亡和线粒体膜电位去极化，显著增加bax、caspase3、caspase9表达，且对人正常肺上皮细胞beas-2b无影响，提示其可能通过线粒体凋亡途径诱导a549细胞凋亡的作用，但如何从东方泽泻中提取出用于治疗肺癌的活性成分化合物，实现在制备抗肺癌药物中的应用，至今未见有公开报道。

技术实现思路

1、针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种从东方泽泻中提取化合物泽泻生物碱a(alismalkaloid a)的方法及其应用，可有效解决从东方泽泻中提取泽泻生物碱，实现在制备治疗肺癌药物中的应用问题。

2、本发明解决的技术方案是，一种从东方泽泻中提取化合物泽泻生物碱a(alismalkaloid a)的方法，该化合物泽泻生物碱a(alismalkaloid a)化学结构式为：

3、

4、其制备方法是，取40-50kg东方泽泻干燥粉碎，用4-6倍泽泻重量体积、质量浓度50％丙酮室温浸渍22-26h，重量体积是指固体以kg计，液体以l计，并用闪式提取器组织破碎提取3次，每次30s，过滤，合并滤液，减压浓缩得浸膏9.5-10.2kg；将浸膏用15-17l水溶解，并依次用等量的石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇各萃取5-7次，分别得石油醚部位、二氯甲烷部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位；各部位浓缩干燥，将二氯甲烷部位(278.4-282.4g)用甲醇溶解，200-300目硅胶拌样装柱，以体积比二氯甲烷︰甲醇＝100:0、80:1、30:1、15:1、8:1、5:1、3:1、2:1和1:1进行梯度洗脱，流速为10ml/min，每200ml检识一次，每个梯度流动相的用量以茴香醛-浓硫酸薄层检识来判断，5-6d洗脱完毕，合并二氯甲烷︰甲醇＝2:1的流份，标为组分c-8，浓缩干燥；组分c-8用甲醇溶解，通过toyopearl hw-40c色谱柱，用体积浓度50％甲醇洗脱，流速0.6ml/min，流动相用量为750-850ml，以茴香醛-浓硫酸薄层检识，合并61-120ml的流份，标为组分c-8-2；组分c-8-2用甲醇溶解，通过toyopearl hw-40c色谱柱，用体积浓度45％甲醇洗脱，流速0.6ml/min，流动相用量为450-550ml，以茴香醛-浓硫酸薄层检识，合并81-135ml的流份，标为组分c-8-2-3；组分c-8-2-3用甲醇溶解，200-300目硅胶拌样装柱，以体积比二氯甲烷︰甲醇＝30:1进行洗脱，流速为5ml/min，以茴香醛-浓硫酸薄层检识，合并44-130ml的流份，标为组分c-8-2-3-3；组分c-8-2-3-3用半制备hplc分离，上规格型号为250×10mm、粒径5μm、孔径12nm的ymc-pack ods-aa色谱柱，流动相为体积比乙腈︰三氟乙酸水溶液＝21:79，所述三氟乙酸水溶液的质量浓度为万分之三，流速3ml/min，收集保留时间tr＝31.0～32.5min的流份，浓缩干燥，得到化合物泽泻生物碱a(alismalkaloid a)。

5、该方法制备的化合物泽泻生物碱a(alismalkaloid a)能显著降低细胞活力与bcl2的表达，诱导a549肺癌细胞凋亡和线粒体膜电位去极化，显著增加bax、caspase3、caspase9表达，且对人正常肺上皮细胞beas-2b无影响，有通过线粒体凋亡途径诱导a549细胞凋亡的作用，实现泽泻生物碱a(alismalkaloid a)在制备治疗肺癌药物中的应用。

6、本发明方法科学合理，新颖独特，易操作，可有效从东方泽泻中提取化合物泽泻生物碱a(alismalkaloid a)，该化合物有通过线粒体凋亡途径诱导a549细胞凋亡的作用，实现泽泻生物碱a(alismalkaloid a)在制备治疗肺癌药物中的应用，开拓了东方泽泻的药用价值和商业价值，有巨大的经济和社会效益。

技术特征：

1.一种从东方泽泻中提取化合物泽泻生物碱a的方法，其特征在于，该化合物泽泻生物碱a(alismalkaloid a)化学结构式为：

2.根据权利要求1所述的从东方泽泻中提取泽泻生物碱a的方法，其特征在于，取45kg东方泽泻干燥粉碎，用5倍泽泻重量体积、质量浓度50％丙酮室温浸渍24h，并用闪式提取器组织破碎提取3次，每次30s，过滤，合并滤液，减压浓缩得浸膏9.8kg；将浸膏用16l水溶解，并依次用等量的石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇各萃取6次，分别得石油醚部位、二氯甲烷部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位；各部位浓缩干燥，将二氯甲烷部位用甲醇溶解，200-300目硅胶拌样装柱，以体积比二氯甲烷︰甲醇＝100:0、80:1、30:1、15:1、8:1、5:1、3:1、2:1和1:1进行梯度洗脱，流速为10ml/min，每200ml检识一次，每个梯度流动相的用量以茴香醛-浓硫酸薄层检识来判断，6d洗脱完毕，合并二氯甲烷︰甲醇＝2:1的流份，标为组分c-8，浓缩干燥；组分c-8用甲醇溶解，通过toyopearl hw-40c色谱柱，用体积浓度50％甲醇洗脱，流速0.6ml/min，流动相用量为800ml，以茴香醛-浓硫酸薄层检识，合并61-120ml的流份，标为组分c-8-2；组分c-8-2用甲醇溶解，通过toyopearl hw-40c色谱柱，用体积浓度45％甲醇洗脱，流速0.6ml/min，流动相用量为500ml，以茴香醛-浓硫酸薄层检识，合并81-135ml的流份，标为组分c-8-2-3；组分c-8-2-3用甲醇溶解，200-300目硅胶拌样装柱，以体积比二氯甲烷︰甲醇＝30:1进行洗脱，流速为5ml/min，以茴香醛-浓硫酸薄层检识，合并44-130ml的流份，标为组分c-8-2-3-3；组分c-8-2-3-3用半制备hplc分离，上规格型号为250×10mm、粒径5μm、孔径12nm的ymc-pack ods-aa色谱柱，流动相为体积比乙腈︰三氟乙酸水溶液＝21:79，所述三氟乙酸水溶液是质量浓度为万分之三，流速3ml/min，收集保留时间tr＝31.0～32.5min的流份，浓缩干燥，得到化合物泽泻生物碱a(alismalkaloid a)。

3.根据权利要求1所述的从东方泽泻中提取泽泻生物碱a的方法，其特征在于，取42kg东方泽泻干燥粉碎，用4倍泽泻重量体积、质量浓度50％丙酮室温浸渍25h，并用闪式提取器组织破碎提取3次，每次30s，过滤，合并滤液，减压浓缩得浸膏9.8kg；将浸膏用15.5l水溶解，并依次用等量的石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇各萃取5次，分别得石油醚部位、二氯甲烷部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位；各部位浓缩干燥，将二氯甲烷部位用甲醇溶解，200-300目硅胶拌样装柱，以体积比二氯甲烷︰甲醇＝100:0、80:1、30:1、15:1、8:1、5:1、3:1、2:1和1:1进行梯度洗脱，流速为10ml/min，每200ml检识一次，每个梯度流动相的用量以茴香醛-浓硫酸薄层检识来判断，5d洗脱完毕，合并二氯甲烷︰甲醇＝2:1的流份，标为组分c-8，浓缩干燥；组分c-8用甲醇溶解，通过toyopearl hw-40c色谱柱，用体积浓度50％甲醇洗脱，流速0.6ml/min，流动相用量为750ml，以茴香醛-浓硫酸薄层检识，合并61-120ml的流份，标为组分c-8-2；组分c-8-2用甲醇溶解，通过toyopearl hw-40c色谱柱，用体积浓度45％甲醇洗脱，流速0.6ml/min，流动相用量为460ml，以茴香醛-浓硫酸薄层检识，合并81-135ml的流份，标为组分c-8-2-3；组分c-8-2-3用甲醇溶解，200-300目硅胶拌样装柱，以体积比二氯甲烷︰甲醇＝30:1进行洗脱，流速为5ml/min，以茴香醛-浓硫酸薄层检识，合并44-130ml的流份，标为组分c-8-2-3-3；组分c-8-2-3-3用半制备hplc分离，上规格型号为250×10mm、粒径5μm、孔径12nm的ymc-pack ods-aa色谱柱，流动相为体积比乙腈︰三氟乙酸水溶液＝21:79，所述三氟乙酸水溶液的质量浓度为万分之三，流速3ml/min，收集保留时间tr＝31.0～32.5min的流份，浓缩干燥，得到化合物泽泻生物碱a(alismalkaloid a)。

4.根据权利要求1所述的从东方泽泻中提取泽泻生物碱a的方法，其特征在于，取49kg东方泽泻干燥粉碎，用6倍泽泻重量体积、质量浓度50％丙酮室温浸渍23h，并用闪式提取器组织破碎提取3次，每次30s，过滤，合并滤液，减压浓缩得浸膏10.1kg；将浸膏用17l水溶解，并依次用等量的石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇各萃取7次，分别得石油醚部位、二氯甲烷部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位；各部位浓缩干燥，将二氯甲烷部位用甲醇溶解，200-300目硅胶拌样装柱，以体积比二氯甲烷︰甲醇＝100:0、80:1、30:1、15:1、8:1、5:1、3:1、2:1和1:1进行梯度洗脱，流速为10ml/min，每200ml检识一次，每个梯度流动相的用量以茴香醛-浓硫酸薄层检识来判断，6d洗脱完毕，合并二氯甲烷︰甲醇＝2:1的流份，标为组分c-8，浓缩干燥；组分c-8用甲醇溶解，通过toyopearl hw-40c色谱柱，用体积浓度50％甲醇洗脱，流速0.6ml/min，流动相用量为850ml，以茴香醛-浓硫酸薄层检识，合并61-120ml的流份，标为组分c-8-2；组分c-8-2用甲醇溶解，通过toyopearl hw-40c色谱柱，用体积浓度45％甲醇洗脱，流速0.6ml/min，流动相用量为550ml，以茴香醛-浓硫酸薄层检识，合并81-135ml的流份，标为组分c-8-2-3；组分c-8-2-3用甲醇溶解，200-300目硅胶拌样装柱，以体积比二氯甲烷︰甲醇＝30:1进行洗脱，流速为5ml/min，以茴香醛-浓硫酸薄层检识，合并44-130ml的流份，标为组分c-8-2-3-3；组分c-8-2-3-3用半制备hplc分离，上规格型号为250×10mm、粒径5μm、孔径12nm的ymc-pack ods-aa色谱柱，流动相为体积比乙腈︰三氟乙酸水溶液＝21:79，所述三氟乙酸水溶液的质量浓度为万分之三，流速3ml/min，收集保留时间tr＝31.0～32.5min的流份，浓缩干燥，得到化合物泽泻生物碱a(alismalkaloid a)。

5.权利要求1-4任一项所述方法提取的泽泻生物碱a(alismalkaloid a)在制备治疗肺癌药物中的应用。

技术总结
本发明涉及从东方泽泻中提取化合物泽泻生物碱A的方法及其应用，可有效解决从东方泽泻中提取泽泻生物碱，实现在制备治疗肺癌药物中的应用问题。该化合物泽泻生物碱A能显著降低细胞活力与Bcl2的表达，诱导A549肺癌细胞凋亡和线粒体膜电位去极化，显著增加Bax、Caspase3、Caspase9表达，且对人正常肺上皮细胞BEAS‑2B无影响，有通过线粒体凋亡途径诱导A549细胞凋亡的作用，实现泽泻生物碱A在制备治疗肺癌药物中的应用。本发明方法科学合理，新颖独特，易操作，可有效从东方泽泻中提取化合物泽泻生物碱A，该化合物有通过线粒体凋亡途径诱导A549细胞凋亡的作用，实现泽泻生物碱A在制备治疗肺癌药物中的应用，开拓了东方泽泻的药用价值和商业价值。

技术研发人员：冯敖梓,朱登辉,李婉,李莉,何宁霞,胡楠,李淑娜,黄礼莹
受保护的技术使用者：暨南大学附属第一医院（广州华侨医院）
技术研发日：
技术公布日：2024/5/10