一种实时荧光定量PCR检测犬肺炎病毒的引物探针组合、试剂盒及方法与流程

本发明属于生物检测领域，特别是涉及一种实时荧光定量pcr检测犬肺炎病毒的引物探针组合、试剂盒及方法。

背景技术：

1、犬肺炎病毒（canine pneumovirus, 可简称为cpv）是一种近年新发现的感染犬类的病毒，由美国的两个动物收容所对狗的呼吸道疾病进行的回顾性实验中发现。此后，北美、欧洲和亚洲均有从犬传染性呼吸道疾病的犬中发现犬肺炎病毒的报道。cpv感染后容易使犬受到继发性病毒或细菌感染，导致长期或更严重的临床疾病，通常在犬舍和动物收容所等密集居住环境中经常发生，cpv感染从6个月幼犬开始，主要见于细支气管上皮细胞中，感染后的阳性犬无发热迹象，可能会出现食欲不振、咳嗽和/或流鼻物和支气管肺炎等症状。基因组分析表明，cpv属于副粘病毒科肺炎病毒亚科肺炎病毒属，是一种包膜的负链单股不分节rna病毒，全长约15 kb。

2、现有技术中，犬肺炎病毒检测方法主要包括分离培养、血清学检测或常规pcr等，分离培养的优点在于分离培养出来的是活的病毒，诊断的特异性为100%，但该方法病毒培养耗时较长，容易被其他病原微生物污染，灵敏度较低，且对培养要求较高，不能满足临床诊断的需求；血清学检测方法与各种病原体之间存在交叉反应，易产生假阳性，给病原体鉴别诊断提供了一定的困难；常规pcr检测技术灵敏度不高，容易受到环境的污染而产生假阳的情况，且无法实时监测pcr过程。

3、目前，国内犬肺炎病毒相关的研究较少。目前市面上鲜有报道能够特异性检测犬肺炎病毒的实时荧光定量pcr试剂盒。因此，本领域亟需建立一种快速、准确和灵敏度高的检测方法，对犬肺炎病毒的检测和流行病学调查以及相关疫苗及药物的研发提供可靠依据，产生积极的影响。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明提供一种实时荧光定量pcr检测犬肺炎病毒的引物探针组合，所述引物探针组合包括：

2、正向引物：5’- gggtgtgcagtacatggc -3’，如seq id no:1所示；

3、反向引物：5’- agtattatggatgaatttggcagct -3’，如seq id no:2所示；

4、探针：5’- tgcagtcccttcccacgaggt -3’，如seq id no:3所示，所述探针中，5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。

5、具体地，所述荧光报告基团选自fam、vic、joe、tet、cy3、cy5、rox、texas red或lcred460中的任意一种，所述荧光淬灭基团选自bhq1、bhq2、bhq3或mgb中任意一种。

6、本发明的第二方面提供了前述的实时荧光定量pcr检测犬肺炎病毒的引物探针组合在制备检测犬肺炎病毒试剂盒中的应用。

7、本发明的第三方面提供了一种实时荧光定量pcr检测犬肺炎病毒的试剂盒，所述试剂盒包括pcr扩增试剂、阴性对照和阳性对照，所述pcr扩增试剂包括前述的基于pcr技术检测犬肺炎病毒的引物探针组合，其中，正向引物的浓度为0.1-1.0 μm，反向引物的浓度为0.1-1.0 μm，探针的浓度为0.1-1.0 μm。

8、具体地，所述pcr扩增试剂还包括pcr反应液、酶混合液和无菌无酶水。

9、具体地，所述pcr反应液包括mgcl2、tris、bsa和dntps，其中，mgcl2的浓度为1-5mm，tris的浓度为30-70 mm，bsa的浓度为100-400 mg/l，dntps的浓度为10-100 mμ。

10、具体地，所述酶混合液包括5-10 u/μl的dna聚合酶和1-5 u/μl热启动修饰抗体。

11、具体地，所述阳性对照为犬肺炎病毒保守基因序列区域的质粒，所述阴性对照为无菌无酶水。

12、本发明的第四方面提供了一种非诊断目的的基于前述的实时荧光定量pcr检测犬肺炎病毒的试剂盒的检测方法，包括步骤：

13、1）提取待测样本总dna；

14、2）制备反应体系，所述反应体系包括所述pcr扩增试剂；

15、3）以提取的待测样本总dna为模板，同时添加阴性对照和阳性对照为质控模板，进行实时荧光定量pcr反应；

16、4）反应结束，根据ct值判定检测结果。

17、具体地，所述实时荧光定量pcr反应的程序为：

18、step1：48℃，10 min；

19、step2：94℃，3 min；

20、step3：94℃，10 s，60℃，30 s；

21、执行40个循环，60℃设置采集荧光信号。

22、有益效果：

23、本申请提供了用于实时荧光定量pcr检测犬肺炎病毒的正、反向引物以及探针，能够快速且准确地检测出待测样本中犬肺炎病毒基因，特异性强、灵敏度高，可应用于犬肺炎病毒的及时检测与防治，对犬肺炎病毒流行病学调查以及相关疫苗及药物的研发提供可靠依据，产生积极的影响。

技术特征：

1.一种实时荧光定量pcr检测犬肺炎病毒的引物探针组合，其特征在于，所述引物探针组合包括：

2. 根据权利要求1所述的实时荧光定量pcr检测犬肺炎病毒的引物探针组合，其特征在于，所述荧光报告基团选自fam、vic、joe、tet、cy3、cy5、rox、texas red或lc red460中的任意一种，所述荧光淬灭基团选自bhq1、bhq2、bhq3或mgb中任意一种。

3.权利要求1或2中任一项所述的实时荧光定量pcr检测犬肺炎病毒的引物探针组合在制备检测犬肺炎病毒试剂盒中的应用。

4. 一种实时荧光定量pcr检测犬肺炎病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括pcr扩增试剂、阴性对照和阳性对照，所述pcr扩增试剂包括权利要求1或2中任一项所述的基于pcr技术检测犬肺炎病毒的引物探针组合，其中，正向引物的浓度为0.1-1.0 μm，反向引物的浓度为0.1-1.0 μm，探针的浓度为0.1-1.0 μm。

5.根据权利要求4所述的实时荧光定量pcr检测犬肺炎病毒的试剂盒，其特征在于，所述pcr扩增试剂还包括pcr反应液、酶混合液和无菌无酶水。

6. 根据权利要求4所述的实时荧光定量pcr检测犬肺炎病毒的试剂盒，其特征在于，所述pcr反应液包括mgcl2、tris、bsa和dntps，其中，mgcl2的浓度为1-5 mm，tris的浓度为30-70 mm，bsa的浓度为100-400 mg/l，dntps的浓度为10-100 mμ。

7. 根据权利要求4所述的实时荧光定量pcr检测犬肺炎病毒的试剂盒，其特征在于，所述酶混合液包括5-10 u/μl的dna聚合酶和1-5 u/μl热启动修饰抗体。

8.根据权利要求4所述的实时荧光定量pcr检测犬肺炎病毒的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为犬肺炎病毒保守基因序列区域的质粒，所述阴性对照为无菌无酶水。

9.一种非诊断目的的基于权利要求4-8中任一项所述的实时荧光定量pcr检测犬肺炎病毒的试剂盒的检测方法，其特征在于，包括步骤：

10.根据权利要求9所述的实时荧光定量pcr检测犬肺炎病毒的试剂盒的检测方法，其特征在于，所述实时荧光定量pcr反应的程序为：

技术总结
本发明提供一种实时荧光定量PCR检测犬肺炎病毒的引物探针组合、试剂盒及方法。所述引物探针组合包括正向引物、反向引物和探针，核苷酸序列如SEQ ID NO:1‑3所示。使用本发明提供的引物探针组合检测样本中的犬肺炎病毒，操作简便、快速准确、灵敏度高，对犬肺炎病毒的检测、流行病学调查和相关疫苗及药物的研发产生积极的影响。

技术研发人员：张迪
受保护的技术使用者：深圳市刚竹医疗科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/5/16