用于HAO1基因编辑和治疗PH1的组合物的制作方法

本发明涉及用于控制hao1基因表达的方法和组合物，例如通过引入双链断裂进行hao1基因干扰或基因编辑。

背景技术：

1、ph1（1型原发性高草酸尿症）是一种遗传性疾病，其主要特征是草酸盐在体内异常积聚。这一现象源于agxt基因编码的酶，即丙氨酸乙醛酸氨基转移酶（agt或agt1）中的突变。正常情况下，agt在肝过氧化物酶体中将乙醛酸转化为甘氨酸。然而，在ph1患者中，突变型agt失去了对乙醛酸的正常分解功能，导致乙醛酸及其代谢产物草酸盐在体内累积。人体无法对草酸盐进行有效氧化，ph1患者体内的高水平草酸盐导致尿液中草酸盐水平异常升高，表现为高草酸尿症。

2、在ph1中，过量的草酸盐与钙结合，形成草酸钙，这可能导致在肾和其他器官中广泛沉积草酸钙。草酸钙的积聚可能引发肾钙质沉着症，或形成肾结石和膀胱结石，导致肾损伤。ph1患者常伴有一系列肾脏并发症，包括血尿症、尿路感染、肾损伤和终末期肾病(esrd)。随着时间的推移，患有ph1的患者的肾脏可能逐渐衰竭，血液中的草酸盐水平可能升高。草酸盐在全身组织中沉积，可能导致全身性草酸盐沉着症，其中高水平的血液草酸盐可能引发骨骼、皮肤和眼睛方面的并发症。患有ph1的患者通常在早年就会发展成肾衰竭，此时肾透析或双肾/肝器官移植成为唯一的治疗选择。

3、羟基酸氧化酶1（hao1，hydroxyacid oxidase 1，又称乙醇酸氧化酶[gox或go]）是一种将乙醇酸转化为乙醛酸的关键酶。有研究提出，在患有ph1的个体中抑制hao1将阻断乙醛酸的生成，使过量的乙醇酸通过尿液排出。这一假设已在敲除动物模型中进行了测试，这些模型包括在salido ec等人的研究中描述的动物模型（《美国国家科学院院刊(pnas)》103(48):18249-18254(2006)）。lumasiran (aln-go1)是一种rnai治疗剂，正在临床试验中用于治疗ph1，该治疗剂以靶向hao1 mrna为特征，早期临床研究表明其能够降低尿液中的草酸盐水平。因此，通过干预hao1的活性，这种rnai治疗剂为治疗ph1提供了一种有前途的方法，通过减少乙醛酸的生成来防止草酸盐的过度积聚。

4、目前正在研究使用靶向hao1的小干扰rna(sirna)敲低或反义敲低以进行破坏的方法，但是仍然需要可以产生对hao1的长期抑制的治疗方法，本发明旨在提供一种长期或者永久性治疗ph1的方法。

技术实现思路

1、本发明提供了使用crispr/cas系统敲除hao1基因的组合物和方法，以减少hao1蛋白的产生，从而显著降低或消除乙醛酸的生成。通过改变hao1基因，本发明提供了一种长期或永久性治疗ph1的方法。

2、在一些实施例中，本发明提供了使用引导rna与crispr/cas系统结合的dna结合剂的组合物，该组合物显著降低或敲除hao1基因的表达。通过这种方式，可以有效地阻断乙醛酸的生成，为ph1的治疗提供了一种新的途径。

3、本发明的实施例为治疗1型原发性高草酸尿症提供了创新的解决方案，为患者提供长期和可持续的疗效。

4、在一方面，本发明提供了一种组合物，其中所述组合物包含：

5、a. sgrna（单向导rna）或编码所述sgrna的核酸，所述sgrna包括：

6、i. 选自seq id no: 11- seq id no: 20中至少之一的sgrna；或者

7、ii. 与选自seq id no: 11- seq id no: 20中至少之一的序列具有至少90%相同的sgrna；或者

8、iii. 与选自seq id no: 5- seq id no: 20中至少之一的序列具有至少99%、98%、 97%、 96%、 95%、 94%、 93%、 92%、 91%或者90%相同sgrna；以及任选地

9、b. rna引导的dna结合剂或对rna引导的dna结合剂进行编码的核酸。

10、在某些实施例中，所述sgrna包括以下至少一种修饰：2’-o-甲基修饰、2’-o-(2-甲氧基乙基)修饰、2’-氟修饰和/或硫代磷酸酯修饰。本发明中所述的经修饰的sgrna可改良sgrna及sgrna/cas9复合物的稳定性，且改善cas9(例如spycas9及等效物)切割标靶dna的活性。

11、在某些实施例中，所述rna引导的dna结合剂是cas核酸酶。

12、在某些实施例中，所述rna引导的dna结合剂是来自ii型crispr/cas系统的cas核酸酶；任选地，所述cas核酸酶是cas9核酸酶。

13、在某些实施例中，所述rna引导的dna结合剂具有如seq id no:22所示的序列。

14、在某些实施例中，所述的编码rna引导的dna结合剂的mrna具有如seq id no: 21所示的序列。

15、在某些实施例中，所述组合物包含：

16、1) 包含如seq id no: 11所示的sgrna以及包含如seq id no: 22所示的rna引导的dna结合剂；或者

17、2) 包含如seq id no: 12所示的sgrna以及包含如seq id no: 22所示的rna引导的dna结合剂；或者

18、3) 包含如seq id no: 13所示的sgrna以及包含如seq id no: 22所示的rna引导的dna结合剂；或者

19、4) 包含如seq id no: 14所示的sgrna以及包含如seq id no: 22所示的rna引导的dna结合剂；或者

20、5) 包含如seq id no: 15所示的sgrna以及包含如seq id no: 22所示的rna引导的dna结合剂；或者

21、6) 包含如seq id no: 16所示的sgrna以及包含如seq id no: 22所示的rna引导的dna结合剂；或者

22、7) 包含如seq id no: 17所示的sgrna以及包含如seq id no: 22所示的rna引导的dna结合剂；或者

23、8) 包含如seq id no: 18所示的sgrna以及包含如seq id no: 22所示的rna引导的dna结合剂；或者

24、9) 包含如seq id no: 19所示的sgrna以及包含如seq id no: 22所示的rna引导的dna结合剂；或者

25、10) 包含如seq id no: 20所示的sgrna以及包含如seq id no: 22所示的rna引导的dna结合剂。

26、在某些实施例中，所述组合物包含：

27、1) 包含如seq id no: 11所示的sgrna以及包含如seq id no: 21所示的编码rna引导的dna结合剂的mrna；或者

28、2) 包含如seq id no: 12所示的sgrna以及包含如seq id no: 21所示的编码rna引导的dna结合剂的mrna；或者

29、3) 包含如seq id no: 13所示的sgrna以及包含如seq id no: 21所示的编码rna引导的dna结合剂的mrna；或者

30、4) 包含如seq id no: 14所示的sgrna以及包含如seq id no: 21所示的编码rna引导的dna结合剂的mrna；或者

31、5) 包含如seq id no: 15所示的sgrna以及包含如seq id no: 21所示的编码rna引导的dna结合剂的mrna；或者

32、6) 包含如seq id no: 16所示的sgrna以及包含如seq id no: 21所示的编码rna引导的dna结合剂的mrna；或者

33、7) 包含如seq id no: 17所示的sgrna以及包含如seq id no: 21所示的编码rna引导的dna结合剂的mrna；或者

34、8) 包含如seq id no: 18所示的sgrna以及包含如seq id no: 21所示的编码rna引导的dna结合剂的mrna；或者

35、9) 包含如seq id no: 19所示的sgrna以及包含如seq id no: 21所示的编码rna引导的dna结合剂的mrna；或者

36、10) 包含如seq id no: 20所示的sgrna以及包含如seq id no: 21所示的编码rna引导的dna结合剂的mrna。

37、在另一方面，本发明提供一种药物组合物，其中所述药物组合物包括上述的组合物以及药学上可接受的载体。

38、在又一方面，本发明提供一种上述的组合物权利上述的药物组合物在制备药物中的用途，其中所述药物用于诱导在hao1基因内引入双链断裂（dsb）或单链断裂（ssb）；用于减少、敲低或敲除hao1基因的表达；治疗或预防一型原发性高草酸尿症（ph1）；治疗或预防由ph1引起的晚期肾脏疾病（esrd）；治疗或预防钙草酸盐产生和沉积、高草酸尿症、草酸沉积症和血尿中的任何一种情况；增加血清甘氧酸浓度；降低受试者尿液中的草酸。

39、序列表

40、 hao1_p1(protospacer,exon 1) aatcattgatacaaattagc 1 hao1_s1(spacer, exon1) aaucauugauacaaauuagc 2 hao1_p2(protospacer,exon 2) gtcagcatgccaatatgtgt 3 hao1_s2(spacer, exon2) gucagcaugccaauaugugu 4 hao1_p3(protospacer,exon 3) gcctgtcagtccctgggaac 5 hao1_s3(spacer, exon3) gccugucagucccugggaac 6 hao1_p4(protospacer,exon 4) gaaaattttggagacgacag 7 hao1_s4(spacer, exon4) gaaaauuuuggagacgacag 8 hao1_p5(protospacer,exon5) gctgttaaacatggcttgaa 9 hao1_s5(spacer, exon) gcuguuaaacauggcuugaa 10 hao1_sg1_um aaucauugauacaaauuagcguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu 11 hao1_sg2_um gucagcaugccaauauguguguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu 12 hao1_sg3_um gccugucagucccugggaacguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu 13 hao1_sg4_um gaaaauuuuggagacgacagguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu 14 hao1_sg5_um gcuguuaaacauggcuugaaguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu 15 hao1_sg2_hm1 mg*mu*mc*agcaugccaauauguguguuuuagamgmcmumamgmamamamumamgmcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucamamcmumumgmamamafafafgfumgfgfcfafcfcfgfafgfufcfgfgfufgfcmu*mu*mu*mu 16 hao1_sg2_ hm2 mg*mu*mc*magc*a*fu*fg*fc*fcaauauguguguuuuagamgmcmumamgmamamamumamgmcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucamamcmumumgmamamamamamgmumgmgmcmamcmcmgmamgmumcmgmgmumgmcmu*mu*mu*mu 17 hao1_sg2_ hm3 mg*mu*mc*magc*a*fu*fg*fc*fcaauauguguguuuuagagcumamgmamamamumamgmcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuumgmamamamamamgmumgmgmcmamcmcmgmamgmumcmgmgmumgmcmu*mu*mu*mu 18 hao1_sg2_ hm4 mg*mu*mc*magc*a*fu*fg*fc*fcafafuauguguguuuuagagcumamgmamamamumamgmcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuumgmamamamamamgmumgmgmcmamcmcmgmamgmumcmgmgmumgmcmu*mu*mu*mu 19 hao1_sg2_ hm5 mg*mu*mc*magc*a*fu*fg*fc*fcafafuauguguguuuuagamgmcmumamgmamamamumamgmcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucamamcmumumgmamamamamamgmumgmgmcmamcmcmgmamgmumcmgmgmumgmcmu*mu*mu*mu 20 spcas9 mrna gggaagcucagaauaaacgcucaacuuuggccggaucugccaccauggacaagaaguacuccaucggccuggacaucggcaccaacuccgugggcugggccgugaucaccgacgaguacaaggugcccuccaagaaguucaaggugcugggcaacaccgaccggcacuccaucaagaagaaccugaucggcgcccugcuguucgacuccggcgagaccgccgaggccacccggcugaagcggaccgcccggcggcgguacacccggcggaagaaccggaucugcuaccugcaggagaucuucuccaacgagauggccaagguggacgacuccuucuuccaccggcuggaggaguccuuccugguggaggaggacaagaagcacgagcggcaccccaucuucggcaacaucguggacgagguggccuaccacgagaaguaccccaccaucuaccaccugcggaagaagcugguggacuccaccgacaaggccgaccugcggcugaucuaccuggcccuggcccacaugaucaaguuccggggccacuuccugaucgagggcgaccugaaccccgacaacuccgacguggacaagcuguucauccagcuggugcagaccuacaaccagcuguucgaggagaaccccaucaacgccuccggcguggacgccaaggccauccuguccgcccggcuguccaagucccggcggcuggagaaccugaucgcccagcugcccggcgagaagaagaacggccuguucggcaaccugaucgcccugucccugggccugacccccaacuucaaguccaacuucgaccuggccgaggacgccaagcugcagcuguccaaggacaccuacgacgacgaccuggacaaccugcuggcccagaucggcgaccaguacgccgaccuguuccuggccgccaagaaccuguccgacgccauccugcuguccgacauccugcgggugaacaccgagaucaccaaggccccccuguccgccuccaugaucaagcgguacgacgagcaccaccaggaccugacccugcugaaggcccuggugcggcagcagcugcccgagaaguacaaggagaucuucuucgaccaguccaagaacggcuacgccggcuacaucgacggcggcgccucccaggaggaguucuacaaguucaucaagcccauccuggagaagauggacggcaccgaggagcugcuggugaagcugaaccgggaggaccugcugcggaagcagcggaccuucgacaacggcuccaucccccaccagauccaccugggcgagcugcacgccauccugcggcggcaggaggacuucuaccccuuccugaaggacaaccgggagaagaucgagaagauccugaccuuccggauccccuacuacgugggcccccuggcccggggcaacucccgguucgccuggaugacccggaaguccgaggagaccaucacccccuggaacuucgaggaggugguggacaagggcgccuccgcccaguccuucaucgagcggaugaccaacuucgacaagaaccugcccaacgagaaggugcugcccaagcacucccugcuguacgaguacuucaccguguacaacgagcugaccaaggugaaguacgugaccgagggcaugcggaagcccgccuuccuguccggcgagcagaagaaggccaucguggaccugcuguucaagaccaaccggaaggugaccgugaagcagcugaaggaggacuacuucaagaagaucgagugcuucgacuccguggagaucuccggcguggaggaccgguucaacgccucccugggcaccuaccacgaccugcugaagaucaucaaggacaaggacuuccuggacaacgaggagaacgaggacauccuggaggacaucgugcugacccugacccuguucgaggaccgggagaugaucgaggagcggcugaagaccuacgcccaccuguucgacgacaaggugaugaagcagcugaagcggcggcgguacaccggcuggggccggcugucccggaagcugaucaacggcauccgggacaagcaguccggcaagaccauccuggacuuccugaaguccgacggcuucgccaaccggaacuucaugcagcugauccacgacgacucccugaccuucaaggaggacauccagaaggcccagguguccggccagggcgacucccugcacgagcacaucgccaaccuggccggcucccccgccaucaagaagggcauccugcagaccgugaaggugguggacgagcuggugaaggugaugggccggcacaagcccgagaacaucgugaucgagauggcccgggagaaccagaccacccagaagggccagaagaacucccgggagcggaugaagcggaucgaggagggcaucaaggagcugggcucccagauccugaaggagcaccccguggagaacacccagcugcagaacgagaagcuguaccuguacuaccugcagaacggccgggacauguacguggaccaggagcuggacaucaaccggcuguccgacuacgacguggaccacaucgugccccaguccuuccugaaggacgacuccaucgacaacaaggugcugacccgguccgacaagaaccggggcaaguccgacaacgugcccuccgaggagguggugaagaagaugaagaacuacuggcggcagcugcugaacgccaagcugaucacccagcggaaguucgacaaccugaccaaggccgagcggggcggccuguccgagcuggacaaggccggcuucaucaagcggcagcugguggagacccggcagaucaccaagcacguggcccagauccuggacucccggaugaacaccaaguacgacgagaacgacaagcugauccgggaggugaaggugaucacccugaaguccaagcugguguccgacuuccggaaggacuuccaguucuacaaggugcgggagaucaacaacuaccaccacgcccacgacgccuaccugaacgccguggugggcaccgcccugaucaagaaguaccccaagcuggaguccgaguucguguacggcgacuacaagguguacgacgugcggaagaugaucgccaaguccgagcaggagaucggcaaggccaccgccaaguacuucuucuacuccaacaucaugaacuucuucaagaccgagaucacccuggccaacggcgagauccggaagcggccccugaucgagaccaacggcgagaccggcgagaucgugugggacaagggccgggacuucgccaccgugcggaaggugcuguccaugccccaggugaacaucgugaagaagaccgaggugcagaccggcggcuucuccaaggaguccauccugcccaagcggaacuccgacaagcugaucgcccggaagaaggacugggaccccaagaaguacggcggcuucgacucccccaccguggccuacuccgugcuggugguggccaagguggagaagggcaaguccaagaagcugaaguccgugaaggagcugcugggcaucaccaucauggagcgguccuccuucgagaagaaccccaucgacuuccuggaggccaagggcuacaaggaggugaagaaggaccugaucaucaagcugcccaaguacucccuguucgagcuggagaacggccggaagcggaugcuggccuccgccggcgagcugcagaagggcaacgagcuggcccugcccuccaaguacgugaacuuccuguaccuggccucccacuacgagaagcugaagggcucccccgaggacaacgagcagaagcagcuguucguggagcagcacaagcacuaccuggacgagaucaucgagcagaucuccgaguucuccaagcgggugauccuggccgacgccaaccuggacaaggugcuguccgccuacaacaagcaccgggacaagcccauccgggagcaggccgagaacaucauccaccuguucacccugaccaaccugggcgcccccgccgccuucaaguacuucgacaccaccaucgaccggaagcgguacaccuccaccaaggaggugcuggacgccacccugauccaccaguccaucaccggccuguacgagacccggaucgaccugucccagcugggcggcgacggcggcggcucccccaagaagaagcggaaggugugacuagcaccagccucaagaacacccgaauggagucucuaagcuacauaauaccaacuuacacuuuacaaaauguugucccccaaaauguagccauucguaucugcuccuaauaaaaagaaaguuucuucacauucucucgagaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa 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