一种变温发酵提高纳他霉素产量的方法与流程

本发明涉及一种变温发酵生产纳他霉素的方法，属于纳他霉素生产。

背景技术：

1、纳他霉素是一种高效、安全的抗真菌生物防腐剂，真菌对纳他霉素格外的敏感，一般很低的浓度就能够起到很强的抑制作用，尤其可以抑制有害真菌，有益菌不起作用。由于细菌细胞膜表面没有甾醇化合物，纳他霉素对其不能产生作用，只作用于真菌和霉菌，故能够添加到发酵类产品中抑制真菌和酵母菌，除此之外它还可以抑制真菌毒素的产生。

2、纳他霉素无色无味，将其添加到食品中对口感没有任何影响，且对人体无害，所以是一种安全的食品防腐剂，广泛应用于食品行业的诸多领域，如调味品、焙烤食品、乳酪制品、果蔬汁原浆和易发霉食品等。近年来，国内外对于纳他霉素的需求量持续增长，产能已不能满足市场需求。由于纳他霉素产量较低，工业化生产进展缓慢，导致价格偏高，因此，国内外很多研究者采用菌株选育、发酵培养基优化、发酵工艺优化等方法提高纳他霉素的产量。

3、中国专利cn113913484b公开了一种提高纳他霉素发酵产量的方法及其发酵培养基，提供一种提高纳他霉素发酵产量的发酵培养基，可以广泛的应用于纳他霉素的生产中，提高纳他霉素的产量至5.52g/l，显著高于未添加纳米材料组的2.02g/l，纳他霉素产量提高达到了276.19％。

4、中国专利cn114875100b公开了一种通过提前激活纳他霉素合成来提高纳他霉素发酵产量的方法，采用低氮源发酵培养基进行纳他霉素的前中期发酵，然后再向低氮源发酵培养基中添加高氮源母液，有效地提高了纳他霉素的产量，使得摇瓶发酵产量最高为2.95g/l。采取扩大生产后，在1l发酵体系中，纳他霉素产量为7.88g/l，显著高于正常发酵生产的6.03g/l。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明目的在于提供一种变温发酵生产纳他霉素的方法，通过在发酵培养基中添加莽草酸、油酸甲酯，在发酵过程流加玉米胚芽油，并进行变温发酵，提高褐黄孢链霉菌发酵生产纳他霉素的产量。

2、为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案如下：

3、一种变温发酵提高纳他霉素产量的方法，包括如下步骤：

4、（1）摇瓶种子培养：无菌条件下，将褐黄孢链霉菌孢子涂布于琼脂培养基中，置于培养箱里培养，再将培养好的褐黄孢链霉菌配制成孢子悬浮液，吸取孢子悬浮液加入种子培养基中的三角瓶中，转速为250rpm，温度为30℃，培养20h，得种子液；

5、（2）发酵罐发酵培养：将种子液接种于发酵培养基，进行搅拌培养，培养过程中流加葡萄糖和玉米胚芽油，调控葡萄糖的浓度，并进行变温发酵，结束后得到含纳他霉素的发酵液。

6、本发明根据纳他霉素的生物合成途径，结合褐黄孢链霉菌中与纳他霉素生物合成相关的代谢调节机理，通过添加莽草酸、油酸甲酯和玉米胚芽油，三者均可以增加发酵液中前体浓度，有利于内酯环的形成，通过共同调节作用，实现纳他霉素合成前体物质的积累，油酸甲酯分解产生短链脂肪酸，加快大环内酯的合成，同时产生较多的乙酰辅酶，增强代谢中的酰基转移酶的活性，玉米胚芽油含有多种维生素和矿物质，维生素作为α-酮酸脱羧酶和转酮基酶的辅酶，参与纳他霉素的合成，三种物质协同促进纳他霉素产量的提高。而且进行变温发酵，有助于产生次级代谢产物，有利于纳他霉素的合成。

7、进一步的，步骤（1）中，所述种子培养基的成分及含量为：葡萄糖10g/l，酵母粉6g/l，蛋白胨6g/l，氯化钠5g/l，ph7.4。

8、进一步的，步骤（2）中，按体积计，种子液的加入量为发酵培养基的10%。

9、进一步的，步骤（2）中，所述发酵培养基中添加莽草酸、油酸甲酯。在发酵培养基中添加莽草酸和油酸甲酯可以增加发酵液中前体浓度，有利于内酯环的形成，通过共同调节作用，实现纳他霉素合成前体物质的积累，从而提高纳他霉素发酵水平。在纳他霉素发酵过程中，莽草酸经过分解，产生短链脂肪酸，油酸甲酯分子量较小，更容易被水解代谢，也产生短链脂肪酸，加快大环内酯的合成，同时油酸甲酯水解还会产生较多的乙酰辅酶，增强代谢中的酰基转移酶的活性，从而提高了纳他霉素的产量。

10、进一步的，所述莽草酸的添加量为0.04-0.08g/l、油酸甲酯的添加量为0.1-0.3g/l。

11、进一步的，步骤（2）中，所述发酵培养基的成分及含量为：葡萄糖20g/l，酵母粉4.5-6g/l，蛋白胨20g/l，氯化钠2g/l，硫酸镁1g/l，莽草酸0.04-0.08g/l，油酸甲酯0.1-0.3g/l，ph7.4。

12、进一步的，步骤（2）中，所述搅拌培养的速度为350-500rpm。

13、进一步的，步骤（2）中，培养发酵48h后流加玉米胚芽油，流加速率为0.5ml/h。玉米胚芽油经过分解，产生短链脂肪酸，提高了合成纳他霉素前体浓度，而且玉米胚芽油含有多种维生素和矿物质，维生素作为α-酮酸脱羧酶和转酮基酶的辅酶，参与纳他霉素的合成，有利于提高纳他霉素的产量。

14、进一步的，步骤（2）中，调控葡萄糖浓度＜20g/l。

15、进一步的，步骤（2），所述变温发酵为发酵开始至发酵48h，发酵温度为30℃，发酵48h后，发酵温度为28-26℃，发酵总时间为110h。发酵前期，为了菌体快速生长繁殖，控制温度为30℃；发酵48小时后，抗生素开始产生，温度下调至26-28℃，降温有助于产生次级代谢产物，有利于纳他霉素的合成。

16、进一步的，步骤（2）中，发酵体积为8-10l。

17、进一步的，步骤（2）中，所述发酵液中纳他霉素含量＞17.00g/l。

18、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

19、（1）本发明通过在发酵培养基中添加莽草酸、油酸甲酯，在发酵过程用流加玉米胚芽油，并进行变温发酵，明显提高了褐黄孢链霉菌发酵生产纳他霉素的产量。

20、（2）本发明添加的莽草酸、油酸甲酯和玉米胚芽油，三者均可以增加发酵液中前体浓度，有利于内酯环的形成，通过共同调节作用，实现纳他霉素合成前体物质的积累，油酸甲酯分解会产生较多的乙酰辅酶，增强代谢中的酰基转移酶的活性，玉米胚芽油含有多种维生素和矿物质，维生素作为α-酮酸脱羧酶和转酮基酶的辅酶，参与纳他霉素的合成，三种物质协同促进纳他霉素产量的提高。

21、（3）本发明通过在发酵过程变温发酵，在发酵前期，控制温度为30℃，促进菌体快速生长繁殖，48小时后，抗生素开始产生，降低温度，有利于纳他霉素的合成。

22、（4）本发明方法操作简单便利，无复杂步骤，提高纳他霉素的发酵产量，有利于那他霉素的大规模产业化生产。

技术特征：

1.一种变温发酵提高纳他霉素产量的方法，其特征在于：包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的变温发酵提高纳他霉素产量的方法，其特征在于：步骤（2）中，按体积计，种子液的加入量为发酵培养基的10%。

3.根据权利要求1或2所述的变温发酵提高纳他霉素产量的方法，其特征在于：步骤（2）中，所述发酵培养基中添加莽草酸、油酸甲酯。

4.根据权利要求3所述的变温发酵提高纳他霉素产量的方法，其特征在于：所述莽草酸的添加量为0.04-0.08g/l、油酸甲酯的添加量为0.1-0.3g/l。

5.根据权利要求1所述的变温发酵提高纳他霉素产量的方法，其特征在于：步骤（2）中，所述发酵培养基的成分及含量为：葡萄糖20g/l，酵母粉4.5-6g/l，蛋白胨20g/l，氯化钠2g/l，硫酸镁1g/l，莽草酸0.04-0.08g/l，油酸甲酯0.1-0.3g/l，ph7.4。

6.根据权利要求4所述的变温发酵提高纳他霉素产量的方法，其特征在于：步骤（2）中，所述搅拌培养的速度为350-500rpm。

7.根据权利要求1所述的变温发酵提高纳他霉素产量的方法，其特征在于：步骤（2）中，培养发酵48h后流加玉米胚芽油，流加速率为0.5ml/h。

8.根据权利要求5-7任一所述的变温发酵提高纳他霉素产量的方法，其特征在于：步骤（2）中，调控葡萄糖浓度＜20g/l。

9.根据权利要求8所述的变温发酵提高纳他霉素产量的方法，其特征在于：步骤（2）中，所述变温发酵为发酵开始至发酵48h，发酵温度为30℃，发酵48h后，发酵温度为28-26℃，发酵总时间为110h。

10.根据权利要求9所述的变温发酵提高纳他霉素产量的方法，其特征在于：步骤（2）中，所述发酵液中纳他霉素的含量＞17.00g/l。

技术总结
本发明公开了一种变温发酵生产纳他霉素的方法，属于纳他霉素生产技术领域。该方法包括如下步骤：（1）摇瓶种子培养：无菌条件下，将褐黄孢链霉菌孢子涂布于琼脂培养基中，置于培养箱里培养，再将培养好的褐黄孢链霉菌配制成孢子悬浮液，吸取孢子悬浮液加入种子培养基中的三角瓶中，进行培养，得种子液；（2）发酵罐发酵培养：将种子液接种于发酵培养基，进行搅拌培养，培养过程中流加葡萄糖和玉米胚芽油，并进行变温发酵，得到含纳他霉素的发酵液。发明通过在发酵培养基中添加莽草酸、油酸甲酯，在发酵过程流加玉米胚芽油，并进行变温发酵，提高褐黄孢链霉菌发酵生产纳他霉素的产量，有利于那他霉素的大规模产业化生产。

技术研发人员：周济源,张英华,李海军,徐波,李艳艳,王超
受保护的技术使用者：山东福瑞达生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/5/16