一种氨基化的螯合金属离子催化剂及其制备方法与应用

本发明属于酶的催化及应用，具体涉及一种氨基化的螯合金属离子催化剂及其制备方法与应用。

背景技术：

1、酶是一类具有催化功能的生物分子，它与人类的生产和生活密切相关，世上的所有生物离开酶都不能生存。酶的特点包括高效性、专一性、反应条件温和等。但游离酶稳定性差、易失活且不能重复使用，致使其难以应用到大规模的工业化生产中。为了解决这一难题，固定化酶技术应运而生。固定化酶较游离酶有很多优点，如稳定性高、可进行工艺加工、可重复使用。常用的酶的固定化方法包括吸附法、交联法、共价法和包埋法。其中吸附法和包埋法属于物理方法，交联法和共价法属于化学方法。

2、但是，这些传统方法存在许多不足之处。吸附法容易造成酶的解吸附；共价结合容易破坏酶的结构，造成酶活的回收率大幅度损失；包埋容易造成底物的传质受限；交联反应较为激烈，酶活力损失较大。亲和吸附现在已成为固定化酶中新趋势，近年来已成为普遍使用的固定化方法。亲和吸附固定化酶通过对酶取向性吸附，几乎不影响蛋白质的活性或折叠。在亲和固定化中，酶分子可以与载体上的金属离子形成较为稳定的亲和共价键，其结合力比静电作用力和疏水作用力更加稳定，反应过程中不易脱落。与传统的固定化方法相比，亲和固定化兼顾了活性和稳定性。

3、本发明用到的是固定化金属离子亲和层析技术(immobilized metal ionaffinity chromatography，imac)，imac是基于过渡金属离子(如cu2+、co2+和ni2+)与氨基酸残基上的α-氨基以及侧链含孤对电子的原子(s、o、n)的配位作用进行酶的纯化和固定化的。imac对含多聚组氨酸标签的重组蛋白的高选择性，可以使目标蛋白质通过金属离子牢固的固定在载体上，杂蛋白则由于不带组氨酸标记而不能与金属离子发生进一步的螯合。imac与其他亲和固定化相比具有价格低廉、螯合方便、容量大、可在高浓度下操作、稳定和容易再生的优点。在分离一些治疗用的蛋白时，金属离子如ni2+、cu2+的泄露会对人体产生严重的危害，通过这种方法获得的亲和介质在固定化酶时容易出现固定化酶活较低，反应速度慢，批次稳定性不好的问题。

4、磷酸盐转移和水解反应是激酶和磷酸酶信号通路的基础，对细胞功能和生长调控至关重要，激酶进行有效催化需要辅酶因子的参与，如nadh、atp等，并且需要镁离子的辅助。atp作为反应中的磷酸供体，价格昂贵。在一般的固定化中，常存在atp利用率低，产率低的问题，因此，需要发明一种催化剂不仅能催化反应进行，提高atp的利用率，还能作为载体通过亲和吸附固定化酶，实现酶的重复使用。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种氨基化的螯合金属离子催化剂及其制备方法。

2、本发明还要解决的技术问题是提供上述氨基化的螯合金属离子催化剂在固定化激酶催化反应中的应用。

3、为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

4、一种氨基化的螯合金属离子催化剂的制备方法，包括如下步骤：

5、(1)将螯合镍离子的亲和介质置于pbs缓冲液中，再加入氯化镁溶液进行反应，得到螯合镍离子-镁离子的亲和介质；

6、(2)将步骤(1)得到的螯合镍离子-镁离子的亲和介质置于多氨基聚合物溶液中反应，得到氨基化的螯合镍离子-镁离子的亲和介质，即为所述的催化剂。

7、其中，步骤(1)中，所述的亲和介质包括琼脂糖、树脂、壳聚糖中的任意一种或几种的组合；优选亲和介质为琼脂糖、树脂或壳聚糖。

8、其中，步骤(1)中，所述的pbs缓冲液为30～70mm，ph8～8.5的磷酸钠缓冲液。优选的，pbs缓冲液为50mm，ph8.2的磷酸钠缓冲液。

9、其中，步骤(1)中，所述的螯合镍离子的亲和介质，其在pbs缓冲液中的浓度为50～150mg/ml；优选的，所述的浓度为100mg/ml。

10、其中，步骤(1)中，所述的氯化镁溶液浓度为30～70mm，溶剂为水，氯化镁溶液与pbs缓冲液的体积比为1:(0.5～1.5)。优选的，所述的氯化镁溶液浓度为50mm，溶剂为水，氯化镁溶液与pbs缓冲液的体积比为1:1。

11、其中，步骤(1)中，所述的反应为振荡，优选的反应条件为：温度25℃，振荡1.5～2.5小时，转速180～200rpm。

12、其中，步骤(2)中，所述的多氨基聚合物包括聚赖氨酸、聚乙烯亚胺、聚丙烯酰胺、多聚精氨酸、聚醚胺、糖胺聚糖、四乙烯五胺中的任意一种或几种的组合；优选的，多氨基聚合物为聚赖氨酸或聚乙烯亚胺。

13、其中，步骤(2)中，所述的螯合镍离子-镁离子的亲和介质在多氨基聚合物溶液中的浓度为4～10mg/ml；优选的，所述的浓度为5mg/ml。

14、其中，步骤(2)中，所述的多氨基聚合物溶液浓度为30～70mm，溶剂为纯水。优选的，所述的多氨基聚合物溶液浓度为50mm，溶剂为纯水。

15、其中，步骤(2)中，所述的反应为振荡，优选的反应条件为：温度25℃，振荡0.5小时，转速180～200rpm。

16、其中，步骤(1)和步骤(2)中，待反应结束后，还需要经过洗涤、抽滤才得到对应的亲和介质。具体的，所述的洗涤为纯水洗涤，次数为2～4次，所述的抽滤为真空抽滤，抽滤至干燥。

17、上述制备方法制备得到的氨基化的螯合金属离子催化剂也在本发明所保护的范围之内。

18、具体的，所述的氨基化的螯合金属离子催化剂是一种界面激活激酶催化反应的催化剂，即可以在亲和介质的表面激活各激酶进行催化反应的催化剂。

19、具体的，所述的氨基化的螯合金属离子催化剂还可以作为载体，通过亲和吸附固定化激酶，实现激酶的重复使用。

20、上述氨基化的螯合金属离子催化剂在固定化激酶进行催化反应中的应用也在本发明所保护的范围之内。

21、其中，所述的激酶带有组氨酸标签，包括所述的激酶带有组氨酸标签，包括尿苷-胞苷激酶、腺苷激酶、蛋白激酶、6-磷酸果糖激酶、己糖激酶中的任意一种或几种的组合；优选的，激酶为尿苷-胞苷激酶或腺苷激酶，更优选尿苷-胞苷激酶。

22、上述应用是将氨基化的螯合金属离子催化剂加入tris-hcl缓冲液和激酶的酶溶液中进行固定化反应得到固定化激酶，再利用固定化激酶进行催化反应。

23、其中，所述的tris-hcl缓冲液为50mm ph8.5的tris-hcl缓冲液。

24、其中，其中，所述的氨基化的螯合金属离子催化剂的用量与激酶的酶溶液的酶活没有关系，主要与激酶的酶溶液的蛋白浓度和体积有关。具体的，所述的氨基化的螯合金属离子催化剂与tris-hcl缓冲液、激酶的酶溶液的用量比为：0.3g:(1～100ml)：(1.5～100ml)。优选的，所述的氨基化的螯合金属离子催化剂与tris-hcl缓冲液、激酶的酶溶液的用量比为：0.3g：1ml：1.5ml。优选的，所述的激酶的酶溶液，其激酶蛋白浓度为0.6g/l。

25、其中，所述的固定化反应，其反应条件为：4～10℃、180～200rpm条件下反应1小时。优选的反应条件为：10℃，200rpm的条件下振荡1小时。

26、其中，所述的催化反应，具体是将固定化激酶加入tris-hcl缓冲液中，再加入底物反应液进行催化反应。

27、其中，所述的固定化激酶加入tris-hcl缓冲液，具体是将0.3～0.5g固定化激酶加入tris-hcl缓冲液中，至总体积为3～5ml。

28、其中，所述的底物反应液，其与含有固定化激酶的tris-hcl缓冲液的体积比为：1：(1～1.5)。优选的体积比为1：1。

29、其中，所述的底物包括atp和氯化镁；具体的，所述的atp，其浓度为30～60mm。优选的atp浓度为45mm。

30、其中，所述的催化反应，其反应条件为：30～50℃，180～200rpm的条件下反应5～20分钟。优选的，反应条件为：45℃，200rpm的条件下反应5分钟。

31、有益效果：

32、(1)镁离子与atp的β和γ磷酸基形成复合(mg.atp2-)，再与底物连接形成过渡态，催化剂上的镁离子使附近atp和底物浓度更高，有利于底物与酶的活性中心的结合，催化反应的进行，提高了atp的利用率，酶活有明显提升。

33、(2)经过多氨基聚合物修饰后，催化剂表面的正电荷更高，有利于表面带负电荷的酶吸附，吸附效果更好，催化剂的载率更高。

34、(3)本发明不仅能催化反应的进行，提高atp的利用率，还能作为载体通过亲和吸附固定化酶，吸附效果更好，并实现了酶的重复使用，因而在固定化酶的大规模工业化生产中，具有广阔的应用前景。