SARS-CoV-2病毒样颗粒及其制备方法和应用

本发明属于生物医药领域，特别是涉及sars-cov-2病毒样颗粒及其制备方法和应用，具体涉及一种带有egfp和hibit双标签的sars-cov-2病毒样颗粒及其制备方法和应用。

背景技术：

1、新型冠状病毒(sars-cov-2)，给全球卫生健康体系、经济和社会稳定等带来巨大影响。由于sars-cov-2的高突变频率，仍需要继续探索和开发covid-19的治疗方法和药物。而sars-cov-2活病毒的研究需要在bsl-3实验室内进行，在一定程度上限制了研究的深入。病毒样颗粒(virus-like particles，vlp)与真正的病毒粒子结构和功能相似度高，没有病毒复制所需基因组，安全性高，可以打破高致病性活病毒需要在bsl-3及以上安全级别实验室研究的障碍，在bsl-2实验室广泛模拟活病毒进行科学研究。

2、sars-cov-2vlp模型已经被构建并用于模拟活病毒组装、出芽、成熟和进入过程。然而，如何解决融合蛋白标签受到不同来源的蛋白质之间不相容的限制仍然存在挑战，尤其是当涉及多个蛋白自组装的vlp模型的制备时，每个结构蛋白在vlps组装和运输过程中发挥的作用，但融合蛋白标签后往往会造成其功能异常，或使得这些结构蛋白不能自组装成vlps。例如，b.nal等人此前关于sars-cov vlp的研究当中发现，sars-cov vlp的组装仅能掺入一个荧光蛋白标签，同时构建两个荧光蛋白标签时会造成vlp无法组装。

3、因此，目前仍需要一种带有双标签的sars-cov-2病毒样颗粒及其制备方法，以期拓展其在病毒进入抑制剂筛选中的应用。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明提供一种带有双标签的sars-cov-2病毒样颗粒及其制备方法和应用。具体地，本发明包括以下内容。

2、本发明的第一方面，提供一种带有双标签的sars-cov-2病毒样颗粒的制备方法，其包括以下步骤：

3、(1)分别构建用于表达刺突蛋白(s蛋白)或其变体、膜蛋白(m蛋白)或其变体、包膜蛋白(e蛋白)或其变体和核衣壳蛋白(n蛋白)或其变体的表达载体，其中，在n蛋白基因的3’端连接egfp基因，在e蛋白基因的5’端连接hibit基因(图1-3)；

4、(2)将所述表达载体分别转染至细胞后进行培养，获得含有自组装而成的病毒样颗粒的上清液；

5、(3)将所述上清液进行分离纯化，得到所述sars-cov-2病毒样颗粒。

6、在某些实施方案中，根据本发明所述的带有双标签的sars-cov-2病毒样颗粒的制备方法，其中，通过去除所述刺突蛋白s的信号肽，替换为人cd5信号肽，并在起始密码子前添加kozak序列，在s基因3’端添加6×his标签及终止密码子，插入到pc-dna3.1(+)的bamh和xho酶切位点之间，得到pcdna3.1-s/h重组表达质粒。

7、在某些实施方案中，根据本发明所述的带有双标签的sars-cov-2病毒样颗粒的制备方法，其中，在pc-dna3.1(+)的bamh和xho酶切位点之间依次添加kozak序列、人cd5信号肽、密码子优化后的m基因、6×his标签和终止密码子，得到pcdna3.1-m/h重组表达质粒。

8、在某些实施方案中，根据本发明所述的带有双标签的sars-cov-2病毒样颗粒的制备方法，其中，在pc-dna3.1(+)的bamh和xho酶切位点之间依次添加kozak序列、人cd5信号肽、密码子优化后的e基因、g4s linker、hibit基因、6×his标签和终止密码子，得到pcdna3.1-e-hibit/h重组表达质粒。

9、在某些实施方案中，根据本发明所述的带有双标签的sars-cov-2病毒样颗粒的制备方法，其中，在pc-dna3.1(+)的bamh和xho酶切位点之间依次添加kozak序列、人cd5信号肽、egfp基因、g4s linker、密码子优化后的n基因、6×his标签和终止密码子，得到pcdna3.1-egfp-n/h重组表达质粒。

10、在某些实施方案中，根据本发明所述的带有双标签的sars-cov-2病毒样颗粒的制备方法，其中，所述pcdna3.1-s/h bamh和xho酶切位点之间的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述pcdna3.1-m/h bamh和xho酶切位点之间的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述pcdna3.1-e-hibit/h bamh和xho酶切位点之间的核苷酸序列如seq id no.3所示，所述pcdna3.1-egfp-n/h bamh和xho酶切位点之间的核苷酸序列如seq id no.4所示。

11、在某些实施方案中，根据本发明所述的带有双标签的sars-cov-2病毒样颗粒的制备方法，其中，kozak序列为gccacc，人cd5信号肽氨基酸序列如seq id no.5所示。

12、在某些实施方案中，根据本发明所述的制备带有双标签的sars-cov-2病毒样颗粒的方法，其中，包装细胞接种数量为1×105/孔-6×105/孔，转染时间为4-24h，pcdna3.1-s/h:pcdna3.1-m/h:pcdna3.1-e-hibit/h:pcdna3.1-egfp-n/h四质粒转染比例为(1-8):(1-64):(1-128):(1-128)，转染后培养时间为12-108h。

13、在某些实施方案中，根据本发明所述的制备带有双标签的sars-cov-2病毒样颗粒的方法，其中，采用蔗糖密度梯度离心法进行纯化，收集30-40wt.％之间的白色云雾状条带，用超滤管超滤进行除蔗糖处理，将溶液置换为缓冲液后，得到纯化后的病毒样颗粒(图4)。

14、在某些实施方案中，根据本发明所述的制备带有双标签的sars-cov-2病毒样颗粒的方法，其中，进一步包括使用所述病毒样颗粒侵染靶细胞的步骤。

15、在某些实施方案中，根据本发明所述的制备带有双标签的sars-cov-2病毒样颗粒的方法，其中，所述靶细胞为ace2-293t细胞。

16、在某些实施方案中，根据本发明所述的制备带有双标签的sars-cov-2病毒样颗粒的方法，其中，所述靶细胞接种的数量为5×104/孔-3×105/孔，优选1×105/孔；侵染时间为0.1-12h，优选1-5h，还优选2-4h，最优选3h。

17、在某些实施方案中，根据本发明所述的制备带有双标签的sars-cov-2病毒样颗粒的方法，其中，进一步包括鉴定所述病毒样颗粒的步骤。

18、在某些实施方案中，根据本发明所述的制备带有双标签的sars-cov-2病毒样颗粒的方法，其中，所述鉴定步骤包括：

19、(a)sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳法结果显示出现了s、m、e-hibit和egfp-n蛋白对应条带(图5)，则制备得到病毒样颗粒；或

20、(b)透射电镜观察到直径80-120nm颗粒物(图6)，则制备得到病毒样颗粒；或

21、(c)通过将病毒样颗粒与ace2-293t细胞共孵育，共聚焦显微镜观察带有egfp的病毒样颗粒结合或进入ace2-293t细胞(图7)；或

22、(d)通过将病毒样颗粒与ace2-293t细胞共孵育，使用试剂裂解ace2-293t细胞检测带有hibit标签的病毒样颗粒结合或进入ace2-293t细胞产生荧光信号(图8)。

23、本发明的第二方面，提供一种带有双标签的sars-cov-2病毒样颗粒，其根据第一方面所述的方法制备得到。

24、本发明的第三方面，提供一种筛选sars-cov-2进入抑制剂的方法，其包括使用本发明所述的病毒样颗粒侵染靶细胞的步骤。

25、在某些实施方案中，根据本发明所述的方法，其中，所述靶细胞为ace2-293t细胞。

26、在某些实施方案中，根据本发明所述的方法，其中，所述靶细胞的数量为5×104/孔-3×105/孔，优选1×105/孔；侵染时间为0.1-12h，优选1-5h，还优选2-4h，最优选3h。

27、本发明带双标签的sars-cov-2病毒样颗粒既能通过荧光显微镜直接观察病毒的包装和进入过程，又能通过荧光素酶定量病毒样颗粒的包装效率和侵染活性。此外，本发明的病毒样颗粒为筛选或评价sars-cov-2进入抑制剂提供了安全的模型，而且促进了sars-cov-2感染机制的研究。