依克多因合成菌株及其构建方法和应用

本发明属于合成生物学，涉及依克多因合成菌株及其构建方法和应用。

背景技术：

1、依克多因，又称四氢嘧啶，是环状氨基酸的衍生物，是一种重要的相容性溶质。依克多因是耐盐微生物中最广泛的相容性溶质，可以帮助生物抵抗高渗透压的胁迫。在已知的相容溶质，例如海藻糖、谷氨酸和甜菜碱中，依克多因具有很强的细胞保护能力。

2、因其具有长效保湿作用，被广泛应用于化妆品、医药等领域。依克多因是一种比甘油更有效的长效保湿剂，可以通过多种方式减少紫外线和可见光对细胞的伤害，它能够保护皮肤免受氧化损伤，对抗皮肤老化。它也是一种优良的生物功能稳定剂、皮肤保护剂和潜在药物。由于依克多因在化妆品、医药等领域的广泛应用，每年依克多因的需求量约为1.5万吨，市场规模达数十亿美元，零售价约为1000美元/公斤。

3、目前依克多因的发酵工艺中，有使用野生菌发酵和工程改造菌两种路径。野生菌发酵一般需要高盐环境，对发酵设备的腐蚀较严重，而且产量较低。以大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌为主的工程改造菌有更高的生产潜力，但还需要进一步提升产量以降低生产成本。同时，目前已有的高产依克多因菌株都有较低(低于0.3g/g葡萄糖)的产率，这也导致了更高的生产成本。因此目前需要一种能够高产依克多因，且具有较高产率的依克多因合成菌株及发酵方法。本发明是在大肠杆菌mg1655中实现的，通过基因敲除支路有效地提高了产率，并且使用了表达量适中，改造过的pcdfduet进行多质粒同时过表达以减少单个质粒的负担并提高碳流。最终获得了一株依克多因生产菌株及其发酵方法，在有较高产量和生产速率的同时，达到了目前高产菌株报道中最高的产率。

技术实现思路

1、本发明的目的第一目的在于提供一株依克多因合成菌株。

2、为实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：

3、一株依克多因合成菌株，通过在宿主菌中敲除crr基因，过表达ectabc基因簇和使用另一表达量适中的质粒过表达lysc(c1055t)基因获得；所述宿主菌为大肠杆菌(escherichia coli)mg1655；所述crr基因的核苷酸序列如seq id no：1；所述ectabc基因簇的核苷酸序列如seq id no：2所示；所述另一质粒为将启动子替换为trc启动子的pcdfduet质粒；所述lysc基因来自大肠杆菌mg1655，有抗反馈抑制突变(c1055t)，其核苷酸序列如seq id no：3所示。

4、本发明的第二目的在于提供上述述菌株的构建方法，包括：

5、使用crispr-cas9技术对大肠杆菌mg1655中的crr基因进行敲除；

6、扩增ectabc基因簇基因序列，以酶切一步克隆方式插入载体质粒，获得表达质粒；

7、扩增lysc基因序列，以酶切一部克隆的方式对其进行突变并插入另一载体质粒，获得表达质粒；

8、将表达质粒分别导入宿主菌中，获得所述依克多因合成菌株。

9、作为一种优选的实施方式，ectabc基因簇插入的载体质粒选用ptrc99a。

10、作为一种优选的实施方式，lysc基因插入的载体质粒选用pcdftrc，其为更改了trc启动子的pcdfduet质粒。使用如下两对引物分别扩增pcdfduet质粒和ptrc99a质粒，并使用一步克隆进行连接，获得质粒pcdftrc：

11、pcdf k-f：5’-ctgaaacctcaggcatttgag-3’

12、pcdf k-r：5’-atttcctaatgcaggagtcgc-3’

13、trcp2-f：

14、5’-gcgactcctgcattaggaaatgttgacaattaatcatccggctc-3’

15、trcp2-r：

16、5’-ctcaaatgcctgaggtttcaggtctcatgagcggatacatatttg-3’

17、作为一种优选的实施方式，使用如下引物扩增ectabc基因簇基因序列：

18、ectaf：

19、5’-catggaattcgagctcggtaccatgagcacgccaataatacc-3’

20、ectcr：5’-caggtcgactctagaggatccctcaccagtaggtgcggcg-3’。

21、作为一种优选的实施方式，使用如下两对引物分别扩增lysc基因簇基因序列：

22、eclysc p1a-f：

23、5’-tggaattcgagctcggtacctgacacgaggtagttatgtc-3’

24、ectov-eclysc p1-r：5’-tcaaggattaatgccacgct-3’

25、ectov-eclysc p2-f：5’-agcgtggcattaatccttga-3’

26、eclysc p2-r：5’-caggtcgactctagaggatccctgttactcaaacaaattactatgcag-3’。

27、本发明的第三目的在于提供上述菌株在发酵生产依克多因中的应用。

28、作为一种优选的实施方式，菌株发酵的发酵培养基组成为：碳源20-30g/l、氮源6g/l、柠檬酸钠二水合物1g/l，磷酸二氢钾2g/l，硫酸镁1.2g/l，硫酸铁0.1g/l，硫酸锰0.1g/l。

29、碳源为葡萄糖、果糖或甘油中的至少一种，氮源为氯化铵或硫酸铵，培养基不包含有机氮源，价格较低且有利于产物分离。

30、作为一种优选的实施方式，使用发酵罐发酵时，通过流加补料补加碳源，保持碳源浓度在1-5g/l。

31、作为一种优选的实施方式，使用发酵罐发酵时，在od达到5-8时添加诱导剂iptg，终浓度为0.1mmol。

32、作为一种优选的实施方式，使用该菌株发酵产依克多因的方式如下：

33、将所述依克多因合成菌株划线至固体lb培养基，在35-39℃下培养8-16h；

34、挑取培养的菌种，接种至液体lb培养基，在35-39℃下培养8-16h，获得种子液；

35、将种子液接种至发酵培养基，加入氨苄青霉素，链霉素和iptg诱导剂，在35-39℃下发酵培养36-100h。

36、氨苄青霉素的添加量为50-100mg/l，链霉素的添加量为30-50mg/l，iptg诱导剂的添加量为0.05-0.2mol/l

37、本发明中，pcdfduet质粒的启动子替换为了trc启动子，使得其能在mg1655中和质粒ptrc99a共同表达，并且可以达到一个适当的表达量。本发明将敲除crr与过表达lysc结合起来构建得到一株可以高效生产依克多因的大肠杆菌，在以无机氮源氯化铵为唯一氮源的培养基上可获得最高产量，且可以取得最高的产率。

38、本发明具有如下有益效果：

39、(1)本发明构建了一株可以高效生产依克多因的大肠杆菌，该大肠杆菌在以无机氮源氯化铵为唯一氮源的培养基上可获得最高产量，且可以取得最高的产率。且培养基不含有机氮源有利于降低成本和产物的纯化。

40、(2)本发明中使用优化的发酵培养基进行或流加补料发酵，最高可以达到115g/l的依克多因产量，产率约为0.45g/g葡萄糖，为菌株工业化合成依克多因提供有利条件。