DPEP1与OPALIN分子作为膜靶点在卵母细胞特异标记、识别及分选中的应用

本发明涉及生殖，具体涉及一种dpep1与opalin分子作为膜靶点在卵母细胞特异标记、识别及分选中的应用。

背景技术：

1、分子生物学的飞速发展已使许多疾病做到了分子诊断，尤其是肿瘤性疾病，然而，生殖领域的临床和实验室研究都还停留在形态学水平，这与活生殖细胞的难以获取和缺乏无创标记手段密不可分，同时微量分析技术的瓶颈也使人们止步于对生殖细胞的形态学分期。众所周知，卵泡是女性性腺卵巢组织中的基本生物学单位，作为生命的起源与繁育的基础，卵泡中卵母细胞的发育需要经历一系列形态学的变化，然而这些形态学变化背后蛋白层面的分子机制至今仍未可知。解析卵母细胞不同发育阶段的分子生物学特点，将为人们了解生殖细胞的发育规律、促进卵母细胞体外成熟技术的进展及靶向性干预卵细胞命运转化方向具有及其深远的实验室和临床意义。

2、近年来单细胞rna测序技术的发展使微量组织或细胞的生理病理过程得以揭示，但卵母细胞在卵巢中占比少、活卵细胞分选受限、卵母细胞直径较大等因素极大地限制了单细胞rna测序技术的应用，从而在一定程度上阻滞了卵细胞发育过程中生理病理相关机制的探究。如何筛选并利用卵母细胞特异性分子示踪卵细胞及利用卵母细胞特异的膜蛋白进行活细胞分选成为了卵母细胞走向分子水平研究的重大难题，尤其是后者，如能发现卵母细胞特异性膜蛋白，将为卵母细胞的活细胞筛选提供技术支持，突破目前卵巢组织单细胞测序中卵母细胞数量严重不足而导致的数据离散和数据匮乏。微量蛋白组学甚至单细胞蛋白组学技术的飞速发展，为筛选卵母细胞特异分子提供了新方向。ipad(integratedproteome analysis device)、nanopots(nanodroplet processing in one pot fortrace samples)、scope-ms(single cell proteomics by mass spectrometry)及oad(nanoliter-scale oil-air-droplet)等技术可在单个细胞中鉴定数百至数千种蛋白质。利用微量蛋白检测技术描绘卵母细胞发育过程中的蛋白组图谱，并针对兴趣蛋白进行验证，或可筛选出卵母细胞特异的膜分子，以利于单细胞检测技术在生殖领域的推广与应用。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服上述背景技术的不足，提供一种dpep1与opalin分子作为膜靶点在卵母细胞特异标记、识别及分选中的应用，本发明通过筛选并提供卵母细胞特异表达的膜分子dpep1与opalin，以利于卵母细胞的鉴定、卵母细胞分选、卵母细胞定位等技术方法，为单细胞测序、活体动态成像等新型技术提供卵母细胞特异靶点。

2、为实现上述目的，本发明提供一种dpep1与opalin分子作为膜靶点在卵母细胞特异标记、识别及分选中的应用。

3、进一步地，所述dpep1的氨基酸序列如seq id no:1所示；所述opalin的氨基酸序列如seq id no:2所示。

4、进一步地，所述dpep1与opalin分子作为膜靶点在卵母细胞特异标记包括利用抗原抗体结合技术、酶联反应技术、荧光染料直接结合技术、遗传修饰技术、放射性核素技术以dpep1或/和opalin为靶点对卵母细胞进行标记。

5、进一步地，所述dpep1与opalin分子作为膜靶点在卵母细胞特异识别通过标记dpep1或/和opalin区分卵母细胞与其他细胞。

6、进一步地，所述dpep1与opalin分子作为膜靶点在卵母细胞分选包括利用细胞流式分选、磁性细胞分选、显微镜下可视化挑选技术通过标记dpep1或/和opalin分离卵母细胞。

7、进一步地，所述卵母细胞包括始基卵泡、初级卵泡、次级卵泡、窦状卵泡、排卵前卵泡中的卵母细胞。

8、进一步地，所述卵母细胞包括人类、小鼠、大鼠、猿猴的卵母细胞；所述卵母细胞包括在体卵母细胞及离体卵母细胞。

9、进一步地，所述dpep1与opalin分子作为膜靶点在卵母细胞特异标记、识别及分选中包括分别靶向dpep1或opalin分子，还包括同时靶向dpep1与opalin分子，通过两者共定位、共表达特性达到标记、识别及分选。

10、再进一步地，dpep1与opalin分子在生信分析、单细胞测序数据分析、空间测序分析中作为卵母细胞marker协助细胞分群及定位分析的应用。

11、更进一步地，dpep1与opalin作为靶点在卵母细胞中表达的应用，采用微量蛋白检测技术检测各级卵泡中卵母细胞的蛋白质表达，利用r软件对发育各阶段卵母细胞的蛋白表达进行差异蛋白分析，筛选仅在某一个或连续多个阶段表达的分子，并综合mrna数据、human protein atlas数据库、geo数据库、pubmed数据库，筛选出组织特异性高的蛋白dpep1与opalin。组织特异性高是指数据库中显示为tissue enriched或者groupenriched。r软件是一套完整的数据处理、计算和制图软件系统，其功能包括：数据存储和处理系统；数组运算工具(其向量、矩阵运算方面功能尤其强大)；完整连贯的统计分析工具；优秀的统计制图功能；简便而强大的编程语言：可操纵数据的输入和输出，可实现分支、循环，用户可自定义功能。

12、与现有技术相比，本发明具有如下优点：

13、其一，本发明利用微量蛋白检测技术对卵母细胞发育各阶段的蛋白进行检测与分析，并整合多种rna数据库资源进行辅助预测与验证，成功筛选出dpep1与opalin蛋白作为卵母细胞特异表达的膜蛋白。dpep1(dipeptidase 1)是一种能水解多种二肽并参与谷胱甘肽代谢的锌金属肽酶，在谷胱甘肽以及肿瘤相关的促炎分子白三烯的调控中起着重要作用。研究表明，dpep1在多种肿瘤中表达异常，如在结肠癌、wilms肿瘤、乳腺癌及胰腺导管腺癌中，dpep1的异常表达不仅影响肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，且与肿瘤患者的预后密切相关。opalin(oligodendrocytic myelin paranodal and inner loop protein)蛋白是特异表达于中枢神经系统髓鞘旁环膜的跨膜唾液糖蛋白，促进少突胶质细胞终末分化，已被发现在坏死性结肠炎急性脑反应、帕金森病及恶性肿瘤中发挥一定的作用；本发明发现opalin在卵母细胞中特异表达，dpep1与opalin分子能够作为膜靶点应用于卵母细胞识别或示踪。

14、其二，本发明dpep1、opalin不仅可作为卵母细胞特异标志分子，协助卵母细胞的标记与识别，且dpep1、opalin作为膜蛋白，可应用于卵母细胞流式分选、活体靶向卵母细胞递送等创新性实验技术，从而协助卵细胞发育机制的相关研究，促进生殖技术领域的迅速发展。

15、其三，本发明在对人类各发育阶段的卵母细胞及颗粒细胞进行微量蛋白组检测时，发现部分膜蛋白在卵母细胞中表达，颗粒细胞中不表达，即存在相对特异性。继而与human protein atlas数据库、geo数据库、pubmed数据库对比后，剔除在上皮细胞、内皮细胞、纤维细胞等细胞中广泛表达的蛋白，筛选出dpep1、opalin为卵母细胞中特异高表达的膜蛋白，并验证其特异性。由此提出dpep1、opalin分子可作为膜靶点应用于卵母细胞特异标记、识别、分选等实验技术中，协助实现流式分选活卵母细胞、活体靶向卵母细胞递送等创新型实验技术。