检测斑石鲷基因间区插入变异的特异性标记、引物、鉴定方法、试剂盒及应用

本发明涉及分子生物学技术，具体的说一种检测斑石鲷（itih4a/itih4b）串联基因间区（dna）插入变异特异性标记、特异性引物、鉴定方法、试剂盒及在雌雄遗传性别鉴定中的应用。

背景技术：

1、斑石鲷是我国具有重要养殖价值的鱼类资源。它属于鲈形目石鲷科石鲷属，主要分布在西太平洋温热带海域。2014年我国首次成功实现斑石鲷人工繁殖和全程人工养殖，并将其引入网箱养殖和工业化养殖模式。现阶段，斑石鲷市场价格每公斤已在200元左右，其养殖效益显著。作为我国本土物种,斑石鲷的资源开发和可持续利用具有长期重要意义。斑石鲷采用x1x1x2x2/x1x2y性别决定机制，雄鱼拥有一条y染色体，生长速度更快。养殖中雄鱼和雌鱼生长速度明显不同，高比例雄鱼苗种有利于提升养殖质量和效率。因此，研发斑石鲷苗种快速鉴定性别技术，将有助于选育生长优良的雄性品种。这将促进斑石鲷养殖水平和产值的提高，也更好利用我国这一宝贵的渔业资源。

2、α-胰蛋白酶抑制剂重链4蛋白（inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain4, itih4），在机体的炎症反应和免疫系统调节中起着至关重要的作用。该基因编码一种参与蛋白酶抑制的蛋白质，蛋白酶是一种分解蛋白质的酶，如果不加以控制，可能会导致组织损伤。通过调节这些蛋白酶的活性，itih4基因有助于防止过度炎症和预防自身免疫性疾病。研究表明，itih4基因的突变或失调可导致各种健康状况，包括慢性炎症性疾病和癌症。了解这种基因的功能对于开发新的治疗方法和疗法至关重要。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服了现有斑石鲷itih4a/itih4b基因间区dna插入变异检测技术不足，提供了一种检测斑石鲷（itih4a/itih4b）串联基因间区（dna）插入变异特异性标记、特异性引物、鉴定方法、试剂盒及在雌雄遗传性别鉴定中的应用。

2、为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

3、一种检测斑石鲷串联基因间区插入变异的特异性标记，检测斑石鲷串联基因间区插入变异特异性标记为斑石鲷itih4a/itih4b基因间区dna片段非插入与插入特异性标记的核苷酸序列，序列为seq id no:1（chrx1inter）和seq id no:2（chryinter）所示碱基。

4、所述斑石鲷itih4a/itih4b基因间区dna片段非插入与插入特异性标记的核苷酸序列seq id no:1所示碱基为斑石鲷雌、雄鱼x1染色体共有itih4a/itih4b基因间区未发生dna插入变异的同源片段，为斑石鲷itih4a/itih4b基因间区碱基非插入与插入个体共有dna特征标记；且，所述seq id no:1所示碱基序列第188位点和189位点之间、第196位点和197位点之间插入序列片段，即为seq id no:2所示碱基序列。

5、一种所述的检测斑石鲷串联基因间区插入变异的特异性标记的应用，所述特异性标记在检测斑石鲷雌雄遗传性别中的应用。

6、一种利用所述特异性标记鉴定斑石鲷基因间区插入变异的方法，

7、1）pcr扩增：取待测斑石鲷，提取基因组dna；以所得基因组dna为模板，采用斑石鲷itih4a/itih4b基因间区特异性引物，进行pcr扩增，并将所得pcr扩增产物与所述的斑石鲷itih4a/itih4b基因间区dna片段非插入与插入特异性标记进行对比；

8、2）结果判断：从待测斑石鲷的基因组dna中扩增出351bp（seq id no:1所示碱基）和755bp（seq id no:2所示碱基）两个dna片段，即为判断该待测斑石鲷为itih4a/itih4b基因间区发生dna片段插入变异个体；

9、3）待测斑石鲷的基因组dna中仅扩增出351bp（seq id no:1所示碱基）的单一dna片段，即为判断该待测斑石鲷为斑石鲷itih4a/itih4b基因间区未发生dna片段插入变异个体。

10、所述特异性引物为

11、chinter_f:1 : 5’- actcttctttctctctctcctc-3’；

12、chinter_r:2 : 5’- caatagtaaacacatcagcc-3’。

13、所述步骤2）中待测斑石鲷个体为雄鱼（x1x2y）；

14、步骤3）中待测斑石鲷个体为雌性（x1x1x2x2）。

15、一种检测所述的斑石鲷串联基因间区插入变异的特异性标记的引物：

16、chinter_f:1 : 5’- actcttctttctctctctcctc-3’；

17、chinter_r:2 : 5’- caatagtaaacacatcagcc-3’。

18、一种鉴定斑石鲷雌雄遗传性别的试剂盒，所述试剂盒含所述的引物。

19、本发明所具有的优点：

20、本发明通过斑石鲷雄鱼融合染色体y上的itih4a/itih4b基因间区与位于雌鱼同源染色体x上的itih4a/itih4b基因间区相比较发生了大片段的dna序列插入，进而高效、快速精准鉴定斑石鲷itih4a/itih4b基因间区是否发生dna片段插入变异，对于揭示斑石鲷雌、雄病害炎症反应异同和免疫系统调节差异研究，实现雌、雄遗传性别的快速鉴定，提升斑石鲷遗传育种进程和优质苗种规模化生产具有重要的意义和应用价值。

21、本发明从斑石鲷全基因组序列中筛选并获得了斑石鲷x和y染色体itih4a/itih4b基因间区同源区段且有大片段dna片段插入标记序列，进一步建立了斑石鲷itih4a/itih4b基因间区dna片段插入变异快速检测方法，采用该方法可以快速、准确和高效的鉴定待检测斑石鲷itih4a/itih4b基因间区是否发生dna序列插入变异。该方法利用一对引物在itih4a/itih4b基因间区dna序列插入变异个体中扩增出755bp和351bp两个相差404bp的条带，在itih4a/itih4b基因间区非dna片段插入个体中仅扩增出351bp的单一条带，并可以通过琼脂糖凝胶电泳分辨，缩短了斑石鲷itih4a/itih4b基因间区变异准确鉴定的时间，提升了检测效率。在斑石鲷基于itih4a/itih4b基因间区变异调控雌、雄病害炎症响应异同和免疫系统调节差异研究及雌雄性别鉴定、高雄苗种制备和家系选育上具有重要的意义和应用价值。

技术特征：

1.一种检测斑石鲷基因间区插入变异的特异性标记，其特征在于：检测斑石鲷串联基因间区插入变异特异性标记为斑石鲷itih4a/itih4b基因间区dna片段非插入与插入特异性标记的核苷酸序列，序列为seq id no:1（chrx1inter）和seq id no:2（chryinter）所示碱基。

2.根据权利要求1所述的检测斑石鲷基因间区插入变异的特异性标记，其特征在于：所述斑石鲷itih4a/itih4b基因间区dna片段非插入与插入特异性标记的核苷酸序列seq idno:1所示碱基为斑石鲷雌、雄鱼x1染色体共有itih4a/itih4b基因间区未发生dna插入变异的同源片段，为斑石鲷itih4a/itih4b基因间区碱基非插入与插入个体共有dna特征标记；且，所述seq id no:1所示碱基序列第188位点和189位点之间、第196位点和197位点之间插入序列片段，即为seq id no:2所示碱基序列。

3.一种权利要求1所述的检测斑石鲷基因间区插入变异的特异性标记的应用，其特征在于：所述特异性标记在检测斑石鲷雌雄遗传性别中的应用。

4.一种利用权利要求1所述特异性标记鉴定斑石鲷基因间区插入变异的方法，其特征在于，

5.根据权利要求4所述的鉴定斑石鲷基因间区插入变异的方法，其特征在于，所述特异性引物为

6.根据权利要求4所述的鉴定斑石鲷基因间区插入变异的方法，其特征在于，步骤2）中待测斑石鲷个体为雄鱼（x1x2y）；

7.一种检测权利要求1所述的斑石鲷基因间区插入变异的特异性标记的引物，其特征在于：

8.一种鉴定斑石鲷雌雄遗传性别的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒含权利要求7所述的引物。

技术总结
本发明涉及分子生物学技术，具体的说一种检测斑石鲷基因间区插入变异的特异性标记、引物、鉴定方法、试剂盒及应用。检测斑石鲷串联基因间区插入变异特异性标记为斑石鲷itih4a/itih4b基因间区DNA片段非插入与插入特异性标记的核苷酸序列，序列为SEQ ID NO:1（ChrX1<subgt;inter</subgt;）和SEQ ID NO:2（ChrY<subgt;inter</subgt;）所示碱基。本发明分子标记缩短了斑石鲷itih4a/itih4b基因间隔区DNA插入变异准确鉴定的时间，提升了检测效率。在斑石鲷基于itih4a/itih4b基因间区开展雌雄性别鉴定、高雄苗种制备和家系选育研究上具有重要的意义和应用价值。

技术研发人员：肖永双,肖志忠,李军,马玉婷,吴燕铎,赵海霞,陈少华,徐平蕊
受保护的技术使用者：中国科学院海洋研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/4/29