棉花事件cI28-3以及用于其检测的引物和方法与流程

本发明属于植物分子生物学领域，尤其是农业生物技术研究中的转基因农作物育种领域，特别是涉及具有提高棉花纤维品质的棉花转化事件，以及检测该转化事件是否存在的特有方法。

背景技术：

1、棉花是重要的经济作物，也是我国重要的经济和战略物资，在国民经济发展中占有十分重要的地位。我国是世界上最大的棉花生产国和消费国，年棉花生产量600万吨左右，占世界产量的1/4以上；年棉花消费量为750万～850万吨，约占全球棉花消费总量的1/3左右。根据国家统计局数据，2021年全国棉花播种面积为4542.2万亩，比上年减少211.2万亩。其中，我国最大产棉区新疆棉花播种面积为3759.1万亩，比上年增加6.2万亩，占比82.8％。

2、随着人民生活水平的提高和纺织技术的革新，对棉花纤维品质的要求也相应提高，尤其是以气流纺纱取代环锭纺纱以来，要求更长、更强、更细和更整齐的纤维。我国棉花主导品种的纤维品质中等,基本能满足纺织工业的要求,但由于我国棉花的品种多、乱、杂，内在品质一致性差、搭配不协调，又加上机采脱叶效果差，造成国产皮棉质量没有保障。我国公检棉花的平均长度主要分布在28～30mm，处在中绒档次。断裂比强度主要分布在26～30cn/tex，能达到aaa档次优质棉要求(≥32cn/tex)的样本极少，反映棉纤维细度的马克隆值指标也偏高。因此，国内棉纺织行业高端产品比较依赖美国、澳大利亚等进口纺高支纱的优质皮棉，但常面临价格波动、供求不稳定等问题。

3、提高产量和改良棉花纤维品质都是当前我国棉花育种的重要目标。在产量方面，棉花衣分(纤维重量占比籽棉重量)是重要的产量因子，籽棉产量相近的情况下，衣分的提高，意味着纤维产量的提高。衣分属多基因控制的数量性状，受环境影响很大，利用常规育种手段，提高优良棉花品种的衣分难度很大。在品质方面，马克隆值非常重要，是纤维细度和成熟度的综合指标。合格的纤维，马克隆值在3.5～5.0之间，用马克隆值5.0以上的纤维纺纱很容易发生断头情况。马克隆值受气候影响很大，同一品种在高温下马克隆值会上升。随着全球气候变暖，棉花马克隆值呈上升趋势。在我国，主导棉花品种马克隆值偏高是一个急待解决的问题。由于马克隆值也是多基因控制的数量性状，因此也是棉花常规育种的难题。总之，由于棉花纤维品质性状与产量性状负相关的现象，当前常规育种方法在同步提高棉花产量和改良棉花品质方面处于瓶颈期。

4、近年来，随着基因组测序、转录组、翻译组、蛋白组、降解组、代谢组、单细胞测序、表观修饰等多组学研究方法的迅速发展，全基因组关联分析的广泛应用，加快了棉花纤维品质关键基因的挖掘。与此同时，转基因技术的日益完善，为大量棉纤维发育相关基因在棉花体内的生物功能验证和优质棉花新材料的创制夯实了基础。目前已报道多个参与纤维发育的关键基因，获得了一批纤维品质明显改良的棉花新材料，极大地推动了纤维发育机理的研究和纤维品质育种的进程。通过转基因技术表明，激素、功能基因和转录因子形成复杂调控网络协调纤维动态发育过程(huang et al 2021)。随着当代分子生物学的发展，转基因育种技术为解决这一问题提供了可行途径。

技术实现思路

1、在一方面，本文提供了一种棉花转化事件，其特征在于，使得在所述棉花的d组13号染色体上以t-dna插入序列替换棉花的部分基因组序列，其中所述t-dna插入序列为seqid no：13所示序列的第1524-6239bp序列，所述部分基因组序列如seq id no：18所示。

2、在一些实施方案中，所述t-dna插入序列的上游侧翼棉花基因组序列为：

3、1)seq id no：13所示序列的第1-1523bp序列；或

4、2)seq id no：13所示序列的第1-1523bp序列的长度不小于100bp的3’端序列。

5、在一些实施方案中，所述t-dna插入序列的下游侧翼棉花基因组序列为：

6、1)seq id no：13所示序列的第6240-6969bp序列；或

7、2)seq id no：13所示序列的第6240-6969bp序列的长度不小于100bp的5’端序列。

8、在一些实施方案中，所述棉花转化事件使得在棉花的d组13号染色体上包括如seqid no：13所示的dna序列，所述dna序列由第1524-6239bp的t-dna插入序列、第1-1523bp的上游侧翼棉花基因组序列和第6240-6969bp的下游侧翼棉花基因组序列构成。

9、在一些实施方案中，所述dna片段从5’端到3’端依次包括：

10、1)上游侧翼棉花基因组序列：seq id no：13所示序列的第1-1523bp序列；或seqid no：13所示序列的第1-1523bp序列的长度不小于100bp的3’端序列；

11、2)t-dna插入序列：seq id no：13所示序列的第1524-6239bp序列；

12、3)下游侧翼棉花基因组序列：seq id no：13所示序列的第6240-6969bp序列；或seq id no：13所示序列的第6240-6969bp序列的长度不小于100bp的5’端序列。

13、另一方面，本文提供了用于检测上述棉花转化事件或上述dna片段的引物对，所述引物对由特异性识别所述上游侧翼棉花基因组序列或所述下游侧翼棉花基因组序列的第一引物和特异性识别所述t-dna插入序列的第二引物组成。

14、在一些实施方案中，所述第一引物的序列如seq id no:14所示，所述第二引物的序列如seq id no:15所示；或者所述第一引物的序列如seq id no:16所示，所述第二引物的序列如seq id no:17所示。

15、另一方面，本文提供了一种鉴定棉花生物样品中是否存在上述棉花转化事件的方法，包括：(a)从待鉴定的所述棉花生物样品提取dna样品；(b)以提取的所述dna样品为模板，使用上述引物对进行pcr扩增；以及(c)检测pcr扩增产物，如果所述pcr扩增产物长度与以seq id no：13所示序列的dna模板扩增获得的长度一致，则表明所述棉花生物样品中存在所述棉花转化事件。

16、另一方面，本文提供了一种获得转基因优质棉花材料的的方法，包括：将含有上述棉花转化事件的棉花材料与其它棉花育种材料进行杂交后，进一步进行回交，以获得含有所述棉花转化事件的新材料(如获得纯系植株)；其中在所述杂交和/或回交过程中，利用上述鉴定方法在后代群体中进行筛选鉴定，确认所述棉花转化事件的存在。

17、另一方面，本文提供了将上述dna片段用于提高棉花纤纤维品质和/或产量、进行棉花育种以及用作分子标记的用途。

技术特征：

1.一种棉花转化事件，其特征在于，使得在所述棉花的d组13号染色体上以t-dna插入序列替换棉花的部分基因组序列，其中所述t-dna插入序列为seq id no：13所示序列的第1524-6239bp序列，所述部分基因组序列如seq id no：18所示。

2.如权利要求1所述的棉花转化事件，其特征在于，所述t-dna插入序列的上游侧翼棉花基因组序列为：

3.如权利要求1或2所述的棉花转化事件，其特征在于，所述t-dna插入序列的下游侧翼棉花基因组序列为：

4.如权利要求1-3任一项所述的棉花转化事件，其特征在于，使得在棉花的d组13号染色体上包括如seq id no：13所示的dna序列，所述dna序列由第1524-6239bp的t-dna插入序列、第1-1523bp的上游侧翼棉花基因组序列和第6240-6969bp的下游侧翼棉花基因组序列构成。

5.dna片段，其特征在于，所述dna片段从5’端到3’端依次包括：

6.用于检测权利要求1-4任一项所述的棉花转化事件或权利要求5所述的dna片段的引物对，其特征在于，由特异性识别所述上游侧翼棉花基因组序列或所述下游侧翼棉花基因组序列的第一引物和特异性识别所述t-dna插入序列的第二引物组成。

7.如权利要求6所述的引物对，其中所述第一引物的序列如seq id no:14所示，所述第二引物的序列如seq id no:15所示；或者所述第一引物的序列如seq id no:16所示，所述第二引物的序列如seq id no:17所示。

8.一种鉴定棉花生物样品中是否存在权利要求1所述的棉花转化事件的方法，其特征在于，包括:

9.一种获得转基因优质棉花材料的的方法，其特征在于，包括：

10.权利要求5所述的dna片段用于提高棉花纤维品质和/或产量、进行棉花育种以及用作分子标记的用途。

技术总结
本发明提供了棉花转化事件cI28‑3以及用于其检测的引物对和方法。携带cI28‑3转化事件的棉花植物在D组13号染色体上包含所述事件即外源插入DNA序列和棉花基因组DNA序列的接合。利用外源插入DNA序列及其侧翼棉花基因组上接合区的DNA序列，可设计检测引物，用于针对cI28‑3事件的特异性检测。针对cI28‑3事件的检测方法可为利用该植物事件进行育种的应用提供便捷的追踪该特定基因插入事件的手段，该特定基因插入事件可作为分子标记使用以提高利用该转化事件的纤维改良育种工作效率。

技术研发人员：王建胜,崔洪志,郭明捷,邓艺,郭晨,胡兰新
受保护的技术使用者：创世纪种业有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/5/16