一种功能性桑叶饲料及其制备方法与应用

本发明涉及生物饲料，尤其涉及一种功能性桑叶饲料及其制备方法与应用。

背景技术：

1、近年来，随着人民生活水平的提高，追求高品质的生活已是大多人的迫切需求，对肉、蛋、奶等营养物质的需求也日益增加，进而促进了畜禽养殖量增加，导致饲料资源需求越来越大，其中蛋白饲料的严重紧缺是畜牧业生产中面临的问题之一。

2、桑树属于桑科（moraceae）桑属（morus），是一种多年生木本植物，桑叶是其主要产出物。5000多年来桑叶主要被用来养蚕纺丝。桑树可以适应各种复杂环境，在大多数温带、热带和亚热带地区均可生长，遍布世界各地。桑叶营养成分全面且均衡，粗蛋白质（cp）（15~35%）、粗脂肪（ee）（3.5%~5.57%）、维生素、矿物质（2.42%~4.71% ca、0.23%~0.97% p）、氨基酸等营养成分含量均高于紫花苜蓿（13.0%~28% cp、1.3%~3.0% ee）。此外，桑叶中含有黄酮类、生物碱、多糖、多酚等天然活性物质，具有显著的降血糖、降脂、抗菌、抗氧化、抗炎等作用。因此，桑叶适合作为优质蛋白质饲料原料应用于动物生产中，如猪、鸡、反刍动物、鱼等。

3、目前，桑叶饲料化的利用多以直接刈割鲜饲，或将新鲜桑叶晒干（或烘干）、粉碎制成桑叶粉后添加到动物饲粮中，这些利用方式虽然简便、易行，在动物养殖方面也取得了一定的效果，但在养殖过程中也逐渐暴露出很多问题。一方面，成熟的桑叶和桑枝中粗纤维含量较高，适口性较差；另一方面，桑叶粗蛋白、水分含量高，极易腐败，不宜长期保存，且存在季节性，利用时间有限，而干燥桑叶则需要消耗大量能源。研究发现，利用不同微生物发酵桑叶，不仅可以提高其营养成分含量，改善适口性，还能够延长保存时间，使鲜桑叶得到充分利用。然而，目前已有发酵菌株和方法制得的发酵桑叶主要作为饲料原料替代豆粕等蛋白质饲料，对畜禽的抗氧化能力、免疫性能和肠道健康以及肉品质等方面的改善作用效果仍较为有限。因此，开发功能性桑叶饲料，在实现蛋白质饲料减量替代的同时，改善畜禽的免疫力、提高畜禽抗氧化能力，生产高品质畜禽产品具有重要的理论价值和实践意义。

技术实现思路

1、本发明提供一种功能性桑叶饲料及其制备方法与应用。

2、发酵菌种对于发酵桑叶的营养成分和功能性成分的组成和含量具有重要影响，为提高发酵桑叶对畜禽的功能性，本发明对制备功能性桑叶饲料的菌种进行了筛选。本发明从畜禽食糜中分离筛选得到多株乳酸菌和芽孢杆菌，通过利用不同菌株及其不同的组合方式对桑叶进行发酵，系统研究了通过多菌协同发酵制备功能性桑叶饲料的方法，筛选得到了最优的发酵菌种组合，利用该发酵菌种组合经发酵制得的功能性桑叶饲料能够显著提高畜禽的抗氧化和免疫功能，同时改善肠道健康，提升肉品质。

3、具体地，本发明提供以下技术方案：

4、第一方面，本发明提供一种发酵菌种组合物，所述发酵菌种组合物包含乳酸片球菌（ pediococcus acidilactici）、戊糖片球菌（ pediococcus pentosaceus）、枯草芽孢杆菌（ bacillus subtilis）和地衣芽孢杆菌（ bacillus licheniformis）；

5、所述乳酸片球菌、戊糖片球菌、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌均保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号分别为cgmcc no. 28922、cgmcc no.28921、cgmcc no. 28923和cgmcc no. 28924。

6、本发明中，所述乳酸片球菌为乳酸片球菌a62，该菌株于2023年11月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），分类命名为乳酸片球菌 pediococcus  acidilactici，保藏编号为cgmcc no. 28922。

7、所述戊糖片球菌为戊糖片球菌a7，该菌株于2023年11月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），分类命名为戊糖片球菌 pediococcus pentosaceus，保藏编号为cgmcc no. 28921。

8、所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌ko1，该菌株于2023年11月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），分类命名为枯草芽孢杆菌 bacillus  subtilis，保藏编号为cgmcc no. 28923。

9、所述地衣芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌do1，该菌株于2023年11月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），分类命名为地衣芽孢杆菌 bacillus  licheniformis，保藏编号为cgmcc no. 28924。

10、上述乳酸片球菌、戊糖片球菌、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌为从畜禽食糜中分离筛选得到，将其组合用于多菌协同发酵制备功能性桑叶饲料，能够显著降低制得功能性桑叶饲料中的粗纤维含量，提高其中粗蛋白的含量，降低ph并提高乳酸含量，且制得功能性桑叶饲料能够显著提高畜禽的抗氧化能力和免疫功能，显著改善畜禽肠道健康，提高畜禽生长性能，提高肉品质和营养价值，提高畜禽养殖的综合经济效益。

11、优选地，所述发酵菌种组合物中，乳酸片球菌、戊糖片球菌、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的有效活菌数之比为（1-3）：（1-3）：（3-10）：（3-10）。

12、第二方面，本发明提供一种桑叶饲料发酵剂，所述发酵剂包含以上所述的发酵菌种组合物。

13、所述桑叶饲料发酵剂中，上述发酵菌种组合物中的乳酸片球菌、戊糖片球菌、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌可以菌液或干粉等液体或固体剂型分别单独包装，或将其中至少两种菌株的菌液或干粉混合包装。

14、优选地，所述发酵剂中，乳酸片球菌、戊糖片球菌、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的有效活菌数之比为（1-3）：（1-3）：（3-10）：（3-10）。

15、上述发酵剂中除包含所述发酵菌种组合物外，还可包含微生物制剂领域允许的载体（例如麸皮、稻壳粉、次粉、玉米芯粉、玉米蛋白粉等）或辅料。所述发酵剂可为液体制剂（例如菌悬液等）或固体制剂（例如干粉）。

16、第三方面，本发明提供以上所述的桑叶饲料发酵剂的制备方法，所述方法包括培养所述乳酸片球菌、戊糖片球菌、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的步骤。

17、所述乳酸片球菌、戊糖片球菌、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的培养可采用本领域常用的乳酸片球菌、戊糖片球菌、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的培养基和方法进行。上述各菌种优选分别进行培养。

18、在本发明的一些实施方式中，所述乳酸片球菌和所述戊糖片球菌的培养使用的培养基包括如下组分：糖蜜4%-6%、豆粕1%-3%、硫酸铵0.08%-0.15%、乙酸钠0.08%-0.15%、磷酸氢二钾0.4%-0.6%、无水硫酸镁0.01%-0.03%、硫酸锰0.004%-0.006%、吐温-80 0.08%-0.15%（v/v），ph 6.3-6.8。

19、在本发明的一些实施方式中，所述枯草芽孢杆菌和所述地衣芽孢杆菌的培养使用的培养基包括如下组分：葡萄糖0.4%-0.6%，豆粕2%-4%，玉米粉2%-4%，酵母浸粉0.3%-0.5%，硫酸锰0.02%-0.04%，ph 6.8-7.5。

20、乳酸片球菌、戊糖片球菌、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的培养的温度优选为35-37℃。

21、第四方面，本发明提供以上所述的发酵菌种组合物或所述桑叶饲料发酵剂在制备发酵桑叶或功能性桑叶饲料中的应用。

22、以上所述的应用包括：采用以上所述的发酵菌种组合物或所述桑叶饲料发酵剂对桑叶进行发酵。

23、第五方面，本发明提供一种功能性桑叶饲料的制备方法，所述方法包括：采用乳酸片球菌、戊糖片球菌、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌对桑叶进行发酵；

24、所述乳酸片球菌、戊糖片球菌、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌均保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号分别为cgmcc no. 28922、cgmcc no.28921、cgmcc no. 28923和cgmcc no. 28924。

25、优选地，所述发酵中，乳酸片球菌、戊糖片球菌、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的接种活菌数之比为（1-3）：（1-3）：（3-10）：（3-10）。

26、优选地，将乳酸片球菌、戊糖片球菌、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌分别活化后于液体培养基培养至对数生长期得到菌液，然后按上述活菌数之比混合后进行接种。

27、在本发明的一些实施方式中，所述乳酸片球菌、戊糖片球菌、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的接种活菌数之比为1:1:3:3、3:1:3:3、1:3:3:3、1:1:10:3或1:1:3:10。优选为1:1:3:3。

28、优选地，所述乳酸片球菌、戊糖片球菌、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的总接种量为2%~8% (v/w)。

29、优选地，所述发酵为厌氧发酵。

30、优选地，所述发酵的温度为23-42℃。更优选为30-37℃。

31、优选地，所述发酵的时间为7-30天。

32、优选地，所述发酵的底料中还添加有发酵辅料，所述发酵辅料为选自麸皮、玉米面、糖蜜中的一种或多种。

33、在本发明的一些实施方式中，所述发酵辅料为麸皮。优选麸皮的添加量为与桑叶质量比为5-15%。

34、在本发明的一些实施方式中，所述方法包括：将桑叶与5%~15% (w/w)的麸皮混匀，按照2%~8% (v/w)的接种量接种由所述乳酸片球菌、戊糖片球菌、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌组成的发酵菌种混合液，充分混匀后，置于23-42℃厌氧发酵7-30天。优选地，所述桑叶为切短至3 cm以内的桑叶或经打浆处理的桑叶。

35、第六方面，本发明提供一种功能性桑叶饲料，其由以上所述的制备方法制备得到。

36、本发明通过试验验证发现，通过在日粮中添加上述功能性桑叶饲料，可以显著提高养殖的经济效益；添加4%-12%的上述功能性桑叶饲料可以显著提高粗纤维表观消化率；显著提高肌肉ph24h、肉色、大理石纹、肌内脂肪含量、蛋白质含量和肌肉必需氨基酸含量，整体改善肉品质；日粮中添加4%-8%的功能性桑叶饲料可以显著降低肌肉的总饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸含量，显著提高多不饱和脂肪酸和功能性脂肪酸含量及pufa/sfa比率；在日粮中添加上述功能性桑叶饲料还能够显著提高抗氧化能力和免疫功能；同时改善肠道形态、肠道脂肪酸含量以及肠道菌群。

37、第七方面，本发明提供以上所述的功能性桑叶饲料的以下任一种应用：

38、（1）在提高畜禽养殖的综合经济效益中的应用；

39、（2）在提高畜禽对养分的消化利用率中的应用；

40、（3）在改善畜禽肉品质中的应用；

41、（4）在改善畜禽肌肉脂肪酸和/或氨基酸含量中的应用；

42、（5）在提高畜禽的抗氧化能力中的应用；

43、（6）在提高畜禽的免疫功能中的应用；

44、（7）在改善畜禽肠道健康和/或提高畜禽肠道短链脂肪酸含量中的应用；

45、（8）在改善畜禽肠道菌群中的应用。

46、本发明还提供以上所述的功能性桑叶饲料在制备具有以上（1）-（8）中任一种或多种功能的产品中的应用。

47、上述（1）中，所述综合经济效益具体包括毛利润等。

48、上述（2）中，所述养分的消化利用率具体包括养分表观消化率等。

49、上述（3）中，所述肉品质具体包括肌肉ph、肉色、大理石纹、肌肉粗蛋白含量、肌内脂肪含量、肌肉嫩度、水分含量、肌肉剪切力等。

50、上述（4）中，改善肌肉脂肪酸含量包括降低总饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸含量，提高多不饱和脂肪酸和功能性脂肪酸含量，和/或提高pufa/sfa比率。改善肌肉氨基酸含量包括提高必需氨基酸含量等。

51、上述（7）中，改善肠道健康包括改善肠道形态等。

52、上述（8）中，改善畜禽肠道菌群包括改善肠道菌群多样性、增加有益菌丰度和/或降低有害菌丰度。

53、本发明中，所述畜禽包括猪、牛、羊、马、驴、鸡、鸭、鹅等。

54、在本发明的一些实施方式中，所述畜禽为猪。

55、本发明的有益效果至少包括：本发明提供的发酵菌种组合物在用于发酵桑叶时，各菌株协同配合作用，能够有效降低发酵桑叶中粗纤维的含量，提高粗蛋白含量，提高乳酸含量、降低ph，制得功能性桑叶饲料能够显著提高畜禽的抗氧化能力和免疫功能，改善畜禽肠道健康，同时能够有效改善肉品质，提高畜禽养殖的综合经济效益，为桑叶在动物生产中的应用提供发酵剂资源和有效的方法。