本发明涉及食品安全检测,更具体地,本发明涉及一种癸氧喹酯半抗原、抗原、抗体及其制备与应用。
背景技术:
1、癸氧喹酯(decoquinate)是一种喹啉类抗球虫药物。喹啉类抗球虫药在抗球虫药物中开发较早,药效较好,至今有几种药物还添加在饲料中,用以防止及治疗球虫病。尽管这类抗球虫药物的毒性较低,但抗球虫药物的使用易导致球虫出现抗药性,畜牧生产中使用抗球虫药物有加大剂量的倾向。
2、近年来,液相色谱-串联质谱检测技术已成为兽药残留检测的主要手段之一,采用液相色谱串联质谱法测定抗球虫药物残留也有不少文献报道,主要针对鸡肉、鸡蛋、牛肉,还有文献报道了鸡皮及脂肪,鸡的排泄物中抗球虫药物残留的检测等。但对肝脏、肾脏等复杂基质中抗球虫药物残留检测的研究较少。
3、基于抗原-抗体特异性识别的免疫分析方法是当前兽药残留检测的主要技术之一,但由于该类药物脂溶性高,溶解性差,半抗原设计及抗体制备困难,目前尚无相关报道。因此,急需可特异性识别癸氧喹酯的单克隆抗体,为开发针对癸氧喹酯的免疫快速检测技术及产品奠定基础。
技术实现思路
1、本发明的目的在于使用水溶性强的手臂接在癸氧喹酯类似物上,获得极性加大水溶性增强的癸氧喹酯半抗原,使得抗原的免疫效果增强。
2、根据本发明的一个方面,提供了癸氧喹酯半抗原,其结构如式(ⅰ)所示:
3、,式(ⅰ)。
4、根据本发明的另一个方面,提供了制备癸氧喹酯半抗原的方法,包括以下步骤:
5、s1. 将4-氨基苯酚与乙氧基亚甲基丙二酸二乙酯溶于异丙醇,在碱性条件下,室温反应,过滤除去不溶物,蒸干溶剂后,得到中间体1,将中间体1溶于二苯基醚,250℃下反应30min,降至室温产物析出,用正己烷洗涤,即得中间体2,该步骤反应式见下式(ⅱ),
6、,式(ⅱ);
7、s2. 将中间体2溶于dmf中,再加入溴代三聚乙二醇乙酸叔丁酯和碳酸钾,其中中间体2、溴代三聚乙二醇乙酸叔丁酯和碳酸钾的摩尔比为1:1:1,升温至90℃反应过夜,加入大量饱和食盐水,用乙酸乙酯萃取,有机层蒸干后,过柱层析,得到中间体3,该步骤反应式见下式(ⅲ),
8、,式(ⅲ);
9、s3. 将中间体3用二氯甲烷溶解后与三氟乙酸反应,反应完毕,蒸干溶剂,得到癸氧喹酯半抗原,其结构式如式(ⅰ)所示,该步骤反应式见下式(ⅳ),
10、,式(ⅳ)。
11、在一些实施方式中,步骤s1中4-氨基苯酚与乙氧基亚甲基丙二酸二乙酯的摩尔比为1:(1-1.2),碱性条件为向反应体系内加入碳酸钾或碳酸钠。
12、根据本发明的再一个方面,提供了癸氧喹酯抗原为癸氧喹酯半抗原与载体蛋白的偶联物。
13、在一些实施方式中,载体蛋白为牛血清白蛋白、人血清白蛋白、鸡卵清白蛋白或血蓝蛋白。
14、根据本发明的第四个方面,提供了癸氧喹酯抗体,癸氧喹酯抗体是由癸氧喹酯抗原经动物免疫制备得到,癸氧喹酯抗体为癸氧喹酯单克隆抗体。
15、根据本发明的第五个方面,提供了癸氧喹酯半抗原、癸氧喹酯抗原在癸氧喹酯的非疾病诊断目的的免疫学检测中的应用。
16、根据本发明的第六个方面,提供了癸氧喹酯抗体在癸氧喹酯的非疾病诊断目的的免疫学检测中的应用。
17、根据本发明的第七个方面,提供了一种非疾病诊断目的的针对癸氧喹酯的检测方法,该方法为利用癸氧喹酯抗原及癸氧喹酯抗体对食品中的癸氧喹酯药物残留进行检测,食品为动物源性食品。
18、本发明的有益效果:本发明通过使用水溶性强的手臂制备得到了结构式如式(i)所示癸氧喹酯半抗原及人工抗原,并进一步制备得到用于检测癸氧喹酯的特异性抗体,对癸氧喹酯的半抑制浓度ic50值为12.3ng/ml,检测限lod(ic10)为3.41 ng/ml,线性范围(ic20~ic80)为7.4~20.9ng/ml,对常见结构类似物的交叉反应率均低于10%,说明该抗体对癸氧喹酯具有良好的特异性,可有效的排除其他结构类似物药物的干扰,为建立癸氧喹酯的免疫检测方法提供了核心试剂。
1.癸氧喹酯半抗原,其特征在于,其结构如式(ⅰ)所示:
2.制备权利要求1所述的癸氧喹酯半抗原的方法,其特征在于,包括以下步骤:
3.根据权利要求2所述的制备癸氧喹酯半抗原的方法,其特征在于,所述步骤s1中4-氨基苯酚与乙氧基亚甲基丙二酸二乙酯的摩尔比为1:(1-1.2),所述碱性条件为向反应体系内加入碳酸钾或碳酸钠。
4.癸氧喹酯抗原,其特征在于,所述癸氧喹酯抗原为权利要求1所述的癸氧喹酯半抗原与载体蛋白的偶联物。
5.根据权利要求4所述的癸氧喹酯抗原,其特征在于,所述载体蛋白为牛血清白蛋白、人血清白蛋白、鸡卵清白蛋白或血蓝蛋白。
6.癸氧喹酯抗体,其特征在于,所述癸氧喹酯抗体是由权利要求5所述的癸氧喹酯抗原经动物免疫制备得到,所述癸氧喹酯抗体为癸氧喹酯单克隆抗体。
7.权利要求1所述的癸氧喹酯半抗原、权利要求4所述的癸氧喹酯抗原在癸氧喹酯的非疾病诊断目的的免疫学检测中的应用。
8.权利要求6所述的癸氧喹酯抗体在癸氧喹酯的非疾病诊断目的的免疫学检测中的应用。
9.一种非疾病诊断目的的针对癸氧喹酯的检测方法,其特征在于,所述方法为利用权利要求4所述的癸氧喹酯抗原及权利要求6所述的癸氧喹酯抗体对食品中的癸氧喹酯药物残留进行检测,所述食品为动物源性食品。