专利名称:用一种吡咯烷化合物控制寄生线虫对植物的病害的方法
本发明涉及对植物和哺乳动物内由寄生线虫引起病害的控制。
自从本世纪四十年代初，许多化合物被用来有效地防治植物寄生线虫。这些化合物常有毒性付作用，例如二溴氯丙烷熏蒸剂，由于它被认为会使工人得不育症，在1977年已禁止市场销售。在六十年代，熏蒸剂型的杀线虫剂被颗粒系列的杀线虫剂广泛取代。此后，草氨酰作为代表性的取代化合物而使用。这些化合物主要是肟甲氨酸酯或有机磷酸酯的衍生物。由于他们具有毒性，不得不在严格控制下使用。因此，如果有对环境有益的杀线虫剂，那将是很有利的，即这种杀线虫剂对非目标生物，它本身是无毒的，并以其降解产物出现。
其它现有技术参见发明简述后的有关段落，否则文章内容将不清楚。
本发明提供2R，5R-二羟甲基-3R，4R-二羟基吡咯烷(DMDP)化合物
或其酸加成盐的使用。它用于控制寄生线虫在植物(包括农作物)和哺乳动物内引起的病害。本发明也包括用DMDP或其所述盐包裹、覆盖或浸渍种子。
DMDP控制寄生线虫在植物上引起病害的机理可包括任何线虫中毒、线虫抑制、对成虫或幼虫的拒食效应，抑制线虫幼虫的孵化、抑制线虫侵食造成对根的损害，并可以进一步推广到对线虫的任何影响来阻止线虫的侵害和/或植物病毒的传播。
DMDP来源于天然物质，并显示出低植物毒性。
DMDP的发现和提取在L.E.Fellows和G.W.J.Fleet的“从植物中获取生物碱糖苷酶抑制剂”文章中描述过(G.H.Wagman和R.Cooper编著，阿姆斯特丹，Elsevier出版的《天然产物分离》1988，第540-565页)。该文综述了DMDP的一些性质，包括杀虫和虫抑制活性。这两种性质经喂食试验验证。这些内容L.E.Fellows在“英国化学”第842-844页(1987)中有更详细的说明。DMDP的这些以及其它性质在L.E.Fellows等人所著，由Plenum出版公司1989年出版的“植物的氮代谢作用”一书第11章，第395-427页中有更深入的说明。尤其在410页[(参见S.V.Evans等人的“昆虫实验应用”第37卷257-261页(1985)]及411页[参见作者本人的研究和W.M.Blaney等人的“昆虫实验应用”36卷，209-216页(1984)]和415页。还可以参考L.E.Fellows等人的“八氢吲嗪三醇及相应的糖苷酶抑制制“(L.James，A.D.Elbein，R.J.Molyneux和C.D.Warren编著，依阿华州立大学出版社出版，1989)第396-416页。在上述文章中，关于DMDP的性质并未提及它的杀线虫作用。
DMDP的进一步优点体现在对植物特别是农作物的施用方式。许多现有杀线虫化合物采用播撒和旋耕混合施加到土壤中。DMDP能用在叶子上，并以某种方式在植物根部产生杀线虫作用。也许DMDP是通过韧皮部传输，但这尚未确定。因此DMDP可以以向叶上喷撒的方式施用，代替上述惯用方式或者除了上述惯用方式外，还可以以向叶上喷洒的方式使用。土壤中施用DMDP的合适剂量为在20cm深度时，至少24到至多48Kg/ha。DMDP也能以在播种前对植物种子预处理的方式使用。
DMDP是水溶性的，因此在使用时不需使用表面活性剂或分散剂。有效成份的优选浓度和使用的配比，取决于使用的方式和所要求的作用效果类型，例如它们可随使线虫中毒和抑制病毒传播而有所不同。叶上喷撒一般建议对一般植物用含有0.01-3.5克/升(优选0.01-1.0克/升)的有效成份，直到喷洒完。低浓度在某些情况下更有用，而高浓度常常也是容许的。
DMDP具有防治损害植物的多种线虫的性质，例如根瘤线虫、孢囊线虫，病毒传播线虫。特别是它能有效地防治下列对农作物有害的线虫属麻黄根瘤线虫(Meloidogyne)，球形线虫(Globodera)，异皮线虫(Heterodera)，内侵线虫(Radopholus)，草地垫刃线虫(Pratylenchus)，赫尔什曼线虫(Hirschmanniella)，盾状线虫(Scutellonema)，螺旋线虫(Helicotylenchus)，麦线虫(Tylenchus)，轮转线虫(Rotylenchus)，双垫刃线虫(Ditylenchus)，长针线虫(Longidorus)，剑线虫(Xiphinema)。对于侵害哺乳动物的线虫，DMDP可以有效杀灭多种蠕线虫，特别是下列种属血矛线虫(Haemonchus)，蒂拉布线虫(Teladorsagia)，细颈线虫(Nematodirus)，毛圆线虫(Trichostrongylus)，网尾线虫(Dictyocaulus)，古柏线虫(Cooperia)，尤其是扭曲血予线虫(Haemonchus contortus)和环状蒂拉布线虫(Teladorsagia Circumcincta)种类(以前分在环状胃线虫(Ostertagia Circumcincta类))。
DMDP可以从鱼藤Benth(豆科)中提取，A.Welter等人在“植物化学”(1976)15卷747-749页中描述。也可以从D-葡萄糖合成[Fuhrman等人在“自然”(1984)307卷755-758页；G.W.J.Fleet和R.W.Smith“四面体通讯”26(11)1465-1468页，(1985)]，或从L-山梨糖合成(P.Card等人，“有机化学期刊”1985，第50期，891-893页)。
上面对DMDP的描述也适用于它的酸加成盐。该盐可以是适应所需的任何一种，例如，假如分别用于植物或非人类动物则在农业和兽医方面是可接受的，这种盐可从游离碱以常用方式制备。
本发明用下述实例说明。“Tween”是一个注册商标。单位ppm表示溶液中1升水所含用于试管试验或叶面的试验化合物的毫克数，在实例中DMDP表示游离碱。例1病毒感染和扩散试验化学物质对通过线虫载体引起的病毒感染的作用试验，是在试验化学物质存在的条件下，将无病毒线虫曝露于被病毒感染的植物源上来进行。将已被处理和未被处理的线虫的病毒传播结果速率进行比较，可以确定化学物质的效能。
一种化学物质对病毒传播是否有作用，是通过线虫感染病毒后，在它们准备侵食植物时使用化学物质来确定的。
试验是在放在恒温箱中的25立方厘米塑料盆中进行的。(Tay-lor和Brown的“线虫药物治疗”1974年2卷171-175页)。用生长三周的杂交矮牵牛属植物Vilm的籽苗，使用的线虫/病毒结合体是载有南芥菜花叶病毒的多尾剑线虫(Xiphinema diver-sicaudatum)。
矮牵牛属植物籽苗放在有3∶1沙与与粘土混合物22毫升的盆中。48小时后，给植物接种病毒。又过24小时后，每个盆中加5个线虫成虫(如果要测试病毒感染，此时加入试验化学物质)。每个试验有10-15个相同样品。四周后，将线虫提取出，加到无病毒受体植物生长的土壤中(如果要做病毒传播试验，此时加入所试验的化学物质)。再过四周后，把线虫取出、记数。清点受体植物根部的咬痕数，将根浸渍，树液施于昆诺阿藜(Chenopodium quinoa)植物的叶上(病毒指示剂)。
12天后，检查昆诺阿藜(Chenopodium quinoa)植物的病毒症状，在两种病毒试验中，每个试验有10-15个相同样品。在所有的情况下，均作不加化学物质的对照实验。
所试验的化学物质是DMDP(15和30ppm)及一种常用的毒线虫毒性化合物草氨酰(7ppm)。
表1a表示DMDP抑制根部虫咬痕形成的效果及与对照实验相比病毒感染的百分数。
表1b表示DMDP抑制根虫咬痕形成的效果及与对照实验相比病毒传播的百分比。
表1a 侵食及通过剑线虫的南芥菜花叶病毒感染试验 咬痕数/根 病毒感染 相同样品数百分比对照物 1.5 33 15DMDP 15ppm 0.5(66％) 27(18％) 15DMDP 30ppm 0.4(74％) 7(79％) 14草氨酰7ppm 0.3(80％) 0(100％) 10
()表示经处理的与对照物相比减少的百分比。
表1b 侵食及通过剑线虫的南芥菜花叶病毒传播。试验 咬痕数/根 病毒感染 相同样品数百分比对照物 1.5 64 11DMDP 15ppm 0.4(74％) 72(0％)* 10DMDP 30ppm 0.5(66％) 18(72％) 11草氨酰7ppm 0.7(53％) 1(98％) 11()表示经处理的与对照物相比减少的百分比*表示经处理的值高于对照物值。例2.孵化试验孵化试验是检测在白色球线虫(一种白色土豆孢囊线虫)(PCN)孵化卵上化学物质的作用效果。
将10个大小及颜色相同的PCN孢囊放入具有0.25ml试验化合物溶液(浓度为50ppm和100ppm)及0.75ml土豆根渗出液的试管中。根渗出液往往刺激孢囊中从卵孵出幼虫。每个试验有4个相同样品。每周移去两次液体，清点孵出的成活及死亡的幼虫数。每次对线虫记数后，补加渗出液/化学物质的混合物。在两次计数之间，试管保持在19℃。
表2a表示孵出的幼虫(死亡或成活)数，取4个重复样品的平均值，同样的数据也用百分数表示效果。本表说明DMDP大大减少了从孢囊中孵出幼虫的数目。
试验用rostochiensis球线虫重复。表2b表示四周后，与对照物相比成活线虫减少的百分比。从表2b可以看出，DMDP比它的酸盐具有更好的效果。
表2a 土豆孢囊线虫孵化试验试验 孵化的幼虫 孵化幼虫总数成活 死亡(增加％*) (增加％)* (减少％)*暴露15天对照物 698 16 714DMDP(50ppm) 374(46) 68(325) 442(38)DMDP(100ppm) 203(71) 91(468) 294(59)暴露24天对照物 1257 32 1289DMDP(50ppm) 1056(16) 112(250) 1168(9)DMDP(100ppm) 601(52) 150(368) 751(42)表2b rostochiensis球线虫(Globodera rostochiensis)孢囊孵化试验试验化合物浓度(ppm) 220 100 50 25 12.5 6.25 3.12DMDP 32 38 52 52 41 0 10DMDP.HCl 0 0 0 0 27 31 21*所有百分比以对照试验值为基数。例3 玻璃试管内的毒性试验将10个活性diversicaudatum剑线虫(xiphinema diversicaudatum)的成虫的若干组分拣到含有蒸馏水的表玻璃中，给定时间内将线虫分批移到1ml试验化合物的等份试样中(以不同的试验化合物浓度)或作为对照加入1ml蒸馏水。每个试验有3个相同样品。两次间隔为48及至72小时，记录下不动的线虫数。如果线虫在同硬毛戳时无反应则认为是不动的。全部试验在5℃时进行。
表3a表示DMDP不同浓度时的试管内毒性试验。所示的不动百分比用Abbott公式按对照试验不动率来校正。记录表明200ppm及以上浓度时试管中毒性是减小的，在25ppm时毒性也存在一个反常的下降。
在类似的试验中发现对成线虫及幼线虫毒性不同。表3b表示从结果中计算出的EC50值(使总数的50％线虫不动所要求的有效浓度)。
试验用rostochiensis球线虫(Globodera rostochiensis)取代diversicaudatum剑线虫重复进行。结果如表3C。从表中可知，DMDP和它的酸盐对线虫是有毒的。
表3a.试管内毒性试验(diversicaudatum剑线虫成虫)试验化合物浓度(ppm) 10 25 50 100 200 500不动百分数DMDP 48小时 15 5 11 35 0 072小时 39 9 63 78 40表3b 试管毒性试验的EC50值(ppm)(diversicaudatum剑线虫)试验化合物 试验线虫级别 试验时间48小时 72小时DMDP 成虫 87.0 44.0DMDP 幼虫 94.0 0.08
表3c 试管内毒性试验(rostochiensis球线虫)试验化合物浓度(ppm) 2.5 10 25 50 100DMDP 25 37 44 50 37DMDP·HCl 88 56 50 50 50例4，表4表示DMDP与剂量有关的活性。进行三个试验分离缶试验、微型盆试验、咬痕试验。
a.分离盆试验本试验表示本发明的抗线虫试剂是否对线虫有防护剂和阻食剂的效果和/或有杀线虫的作用。
所用“分离盆”即用细网筛材料将盆分为两部分(见Alphey等人的“线虫学杂志”1988，11(4)，第399-404页)。每部分分别装入37ml土(砂与粘土为3∶1的混合物)。试验化合物以表4所示浓度加到种植了矮牵牛属植物籽苗一端的土中，另一端加入100个diversicaudatum剑线虫成虫。每个试验做8个相同样品。
21天后，将盆的两半边分开，线虫从两半边土壤中取出，记录试验端植物根的咬痕数目(表4a(i))。清点每半边死亡及成活的线虫数，在表4a(ii)中表示。
表4a(i)表明DMDP在所有试验浓度下对线虫有拒食剂作用。表4a(ii)表示80ppm的DMDP也具有毒线虫作用，在此浓度下在有植物一边线虫的不动数比在使用了草氨酰的盆中多。
b.微型盆试验本试验表明化学物质在土壤中的杀线虫作用以及对线虫进食特性的影响。
矮牵牛花属植物籽苗种到22ml的土中(砂∶粘土＝3∶1)，往土壤中加入有5-10个diversicaudatum剑线虫成虫的试验化合物溶液或水(对照物)，每个试验做10个相同样品。三周后，取出线虫，记录由于线虫侵食根部所产生的咬痕数，以比对照值减少的平均百分数表示。
表4b表示DMDP具有线虫防护剂和拒食剂作用，最有效的DMDP浓度是25ppm。
c.根咬痕试验在根咬痕试验中，将西红柿籽苗(即去掉主根系而刺激产生出的根须)种到含有25克细的、筛过的干砂及350个黄麻根瘤线虫(J2)和DMDP(以水溶液的形式)的试管中。在10至12天后研究DMDP对线虫咬植物根能力的影响。试验中有水对照实验。每个试验做10个相同样品。
从表4c的结果可以看出，DMDP在2.5-25ppm的范围内效果相同，在50和240ppm时效果小些。不同的试验表明，所用的DMDP在2.5ppm和100ppm之间的活性程度相同。
表44a(i)分离盆试验(diversicaudatum剑线虫/矮牵牛属植物)化学物质/浓度(ppm) 咬痕数/根减少的平均值以对照值的％表示DMDP/15 63DMDP/30 83DMDP/80 894a(ii)21天后在分离盆的种植端和未种植端回收的线虫平均数(diversicaudatum剑线虫/矮牵牛属植物)试验化合物 浓度 线虫总数 活动线虫数 不动线虫数(ppm) 种植 未种植 种植 未种植 种植 未种植DMDP 16 27 15 24 10 3 5DMDP 32 24 14 21 11 3 3DMDP 80 25 15 12 11 13 4草氨酰 15 17 21 13 14 4 7对照物 4b，微型盆试验(diversicaudatum剑线虫/矮牵牛属植物)化学物质/浓度(ppm)咬痕/根减少的平均值以对照值的百分比表示每盆5个线虫 每盆10个线虫DMDP/8 70 -DMDP/14 70 -DMDP/25 94 72DMDP/50 72 83DMDP/100 65 1004c.咬痕试验(黄麻根瘤线虫/西红柿)化学物质/浓度(ppm) 咬痕数/根与对照物相比减少的％DMDP/2.5 76DMDP/12.5 70DMDP/25 72DMDP/50 50DMDP/240 47例5.施用方式a/根部施用采用微型盆试验测试抗线虫试剂在被植物系统地吸收时是否效果更好。将杂交的矮牵牛属植物根切掉，从茎的切口长出的新根放入试验化合物溶液中(浓度如表5所示)，试验开始前保持24小时。这些处理过植物对diversicaudatum剑线虫的作用与切口端泡在水中24小时的植物相比较。表5说明随土壤施用后根从土壤中吸收的方式是施用DMDP的合适方法。
(b)叶上施用重复例4所述的微型盆试验和根咬痕试验，但试验化合物是涂在西红柿籽苗的叶面上。在这些试验中，将0.4ml的200ppm试验化合物水溶液(或只是水)与0.05％的“Tween 80”湿润溶液一起涂到叶上。
微型盆试验中虫咬痕根减少86％，在咬痕试验中为79％对照而言，这表明试验化合物在根系产生抗线虫作用。
表5 通过根的吸收活性——详细内容如文中所述。
微型盆试验矮牵牛属植物/剑线虫(21天)化学物质/浓度(ppm) 相对于对照物减少咬痕数(％)草氨酰/50 92DMDP/15 83DMDP/30 100DMDP/100 58例6，植物毒性数据在三种不同的植物样品上以200ppm的浓度试验DMDP，用在微型盆试验中概述的方法进行14天。籽苗生长16天，测量相对于对照植物生长的百分数及根和芽的长度。
表6说明了DMDP对植物生长的影响。所有数字均为相对于对照植物的生长百分数(100％＝与对照植物相同，＞100％＝大于对照物)。
当黑麦草用DMDP试验时，只长了对比植物重量的65％。这种情况在农田中是无关紧要的，因为所用DMDP(200ppm)的浓度两倍于控制线虫所需的有效剂量。
表6.植物毒性数据(均在200ppm泥水中)根的长度 芽的长度 总重量化学物质 TOM OSR RG TOM OSR RG TOM OSR RG草氨酰 107 84 108 91 95 93 103 104 107DMDP 90 98 105 90 97 74 100 100 65植物 TOM＝西红柿(CV.Moneymaker)OSR＝油菜籽(CV.Bienvenue)RG＝黑麦草(CV.Melle)例7 金属罐试验在60毫升干净的小罐中加入约25克土、1毫升试验化合物和1毫升含1500PCN卵的水。将带幼芽的Desiree土豆小片放到该混合料中，用穿了3-4个孔的盖子封闭盖罐子。罐放到托盘中，用黑色聚乙烯遮住，保持20℃的恒温。四周后，计算第一批孢囊数，然后每周计算一次，直到第八周结束。表7表示与对照物相比孢囊减少的百分数，可以看出DMDP在减少孢囊生长数目方面是有效的。
表7 金属罐试验(rostochiensis球线虫)孢囊减少(％)试验化合物浓度(ppm) 3.12 6.26 12.5 25 50 100 200DMDP 7 0 14 46 43 35 7DMDP.HCl 0 0 0 7 7 43 0例8.施用方法(II)作为例5的延续，用砂和土做进一步试验，或用不同的植物和线虫来说明DMDP的不同施用方法。
8(1) 试管中的砂浸试验在多支7.5厘米×2.5厘米的玻璃试管中倒入24.5克筛过的干砂，加4毫升毫微级纯化水并在砂中挖一个坑。在坑中种植西红柿籽苗前，即加入1毫升试验化合物和1毫升含350爪哇根瘤线虫的水。然后所有试管放置14天。在本试验及下述8(2)的试验中，使用前籽苗的制备是将根切掉，使根须再生。表8(1)表示DMDP和它的酸盐在不同浓度时的作用。结果用相对对照物(未加试验化合物)成活线虫减少的百分数来表示。
8(2) 试管中的砂叶试验在3个7.5厘米×2.5厘米的玻璃试管中倒入24.5克筛过的干砂，加5毫升毫微级纯化水，并在试管中种植西红柿籽苗。用不吸收的棉绒塞在籽苗基土的周围，以防砂上喷上试验化合物。试管放入保温箱中过夜。第二天，每棵植物都用喷枪喷洒0.1毫升试验化学物质，再放回保温箱中。一天后，将含有350个爪哇根瘤线虫的1ml水加到每个试管中。所有试管放置14天。表8(2)表示DMDP及其酸盐对植物区域的影响。同表8(1)一样，结果用％表示。
8(3) 叶上应用在2.5厘米的盆中加入75g Levington universal和砂，比率为3∶1。将西红柿苗(生长34天的)种到这些盆中，加入1毫升水。土壤用滤纸保护并将盆放入温室过夜。第二天，每棵植物用喷枪喷洒0.3ml的试验化合物，再放入温室过夜。次日，将滤纸取出，在土壤中加入1毫升含有350个爪哇根瘤线虫(Meloidogyne javanica)或黄麻根瘤线虫(Meloidogyne incognita)的水。在清点了存活及死亡的线虫数后，将盆放置12天。表8(3)表示DMDP对(a)爪哇根瘤线虫和(b)黄麻根瘤线虫的作用。
8(4) 土壤应用重复8(3)的步骤，但在第一天就往土壤中加1毫升试验化合物和1毫升有线虫的水。盆放置14天。结果按通常方式示于表8(4)。
表8(1)砂浸试验爪哇根瘤线虫造成咬痕减少的％试验化合物 浓度(ppm) 200 100 50 25 10 5 1DMDP.HCl 47 51 30 18 43 13DMDP(试验1) 77 72 79 76DMDP(试验2) 56 57 53 56 68 63 71
表8(2)砂叶试验爪哇根瘤线虫造成咬痕减少的％植物 试验化合物 浓度(ppm) 3200 2400 1600 800 400西红柿DMDP 59 0 9DMDP.HCl 18 5 9辣椒DMDP 7 7 30 0DMDP.HCl 9 0 7 0茄子DMDP 38 43 34 9DMDP.HCl 44 50 19 19表8 (3)土壤叶试验。由(a)爪哇根瘤线虫(b)黄麻根瘤线虫造成咬痕减少的％。
试验化合物浓度 1600 1000 800 400 200 100 50 25 10 1 0.1a)DMDP 27 27 22 22a)DMDP 35 28 22 39 34b)DMDP 24 24 26 30 31b)DMDP 23 22
表8(4)砂浸试验。由(a)爪哇根瘤线虫(b)黄麻根瘤线虫造成咬痕减少的％试验化合物浓度(ppm) 100 50 20 10 1.0 0.1 0.01DMDP 28 19 21DMDP 28 30 29 20 8
权利要求
1.使植物免受线虫造成的病害的方法，包括用2R，5R-二羟甲基-3R，4R-二羟基吡咯烷化合物(DMDP)
或其酸加成盐控制由寄生线虫对植物所造成的病害。
2.按权利要求
1的方法，其中化合物是以叶上喷洒的方式施用于植物或农作物。
3.按权利要求
1的方法，其中化合物是经土壤施用到植物上。
4.按权利要求
1、2或3的方法，其中寄生线虫侵害植物或农作物，其属类为根瘤线虫、球线虫或剑线虫。
5.按权利要求
1的方法，包括用所述化合物包裹、覆盖或浸渍种子。
专利摘要
2R，5R-二羟甲基-3R，4R-二羟基吡咯烷(DMDP)化合物或它的酸加成盐在控制由寄生线虫在植物上造成病害方面的应用。
文档编号A01N43/36GKCN1049557SQ91111920
公开日2000年2月23日 申请日期1991年12月3日
发明者T·J·W·阿尔菲, A·N·E·伯奇, L·E·费洛斯, W·M·罗伯逊 申请人:英国技术集团有限公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan非专利引用 (1),