专利名称:一种黄芪中多种异黄酮成分的分离制备方法
技术领域：
本发明涉及一种采用色谱法从黄芪异黄酮提取物中同时分离制备出高纯度的芒柄花素(Formononetin)、3-羟基-9，10-二甲氧基紫檀烷(3-hydroxy-9，10-dimethoxy pterocarpane)和2’，7-二羟基-3’，4’-二甲氧基异黄烷(2’，7-dihydroxy-3’，4’-dimethoxy isoflavane)三种主要单体成分的方法。
背景技术：
黄芪异黄酮是黄芪的次生代谢产物，根据化学结构的不同，主要分为游离型的异黄酮、异黄烷和紫檀烷苷元及其结合型的糖苷类。现代药理研究表明黄芪异黄酮类物质具有抗菌消炎、抗病毒、降血脂、抗癌和具卵泡激素等作用，因此分离制备高纯度的化合物单体成为一个重要的研究内容。芒柄花素的制备主要有提取法和化学合成法两种，而3-羟基-9，10-二甲氧基紫檀烷和2’，7-二羟基-3’，4’-二甲氧基异黄烷的制备只有提取法。经典的化学合成法所需原料或试剂不易得到、且反应产物复杂，分离纯化困难。传统的提取法有步骤繁琐、周期长、重现性差等缺点。所使用的溶剂洗脱系统也较为复杂且毒性大(如氯仿)，溶剂消耗量大。因此需要一种快速、高效、重现性好的分离方法来满足对上述成分的需求。
发明内容本发明的目的旨在提供一种高效、可重复、低成本、高回收率、适合于大量分离制备黄芪异黄酮主要单体组分的方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为一种黄芪中多种异黄酮成分的分离制备方法，采用硅胶层析柱对含有黄芪异黄酮的植物提取物进行富集浓缩后，再通过反相高效液相制备色谱进行分离制备。从而保证了本制备方法在较低的成本和较高收率的情况下满足黄芪异黄酮主要单体组分制备的重复性以及线性放大的要求。
包括以下具体步骤1)先用硅胶层析柱对含有黄芪异黄酮的提取物进行目标成分的富集浓缩；所使用的洗脱剂为石油醚-乙酸乙酯，它们的体积比为1∶1～1.5；2)流出部分用薄层色谱检测，薄层在紫外灯下检出荧光，展开剂为石油醚-乙酸乙酯，它们的体积比为1∶1～1.5；将含有的目标产物Rf≥0.62部分合并，浓缩成浸膏后；3)用甲醇-氯仿溶液体系溶解，甲醇-氯仿的体积比为1∶2～3，过滤膜，用高效液相制备色谱对其进行分离、纯化而得到芒柄花素、9，10-二甲氧基紫檀烷和2’，7-二羟基-3’，4’-二甲氧基异黄烷三个化合物的纯品。
所述步骤1)的具体过程为，将黄芪总黄酮粗提物用甲醇溶解，与硅胶拌样，样品与硅胶的质量比为1∶2～3，拌样均匀后，挥干溶剂，研磨均匀，用硅胶填充层析柱进行柱层析；柱层析所用石油醚的沸点范围为60～90℃，硅胶为100～200目；所述步骤3)中所用的滤膜0.2～0.5μm；高效液相制备色谱是反相高效液相制备色谱，填充材料为反相硅胶C18，粒径5～10μm；流动相(即洗脱剂)为甲醇和含甲酸的水溶液两相体系，两相溶剂以体积分数比为45∶55～55∶45进行洗脱，添加甲酸浓度范围为0.1～0.5％；控制流速为19～300ml/min；同时采用紫外检测器230nm在线监测流出曲线。
本发明具有如下优点1.分离到的化合物纯度高。本发明公开了黄芪异黄酮主要单体组分的分离、纯化方法，所用的是反相高效液相色谱法，具有能够保证较高的峰型分离度、重现性好、时间短、分离量大、回收率高、分离环境缓和、节约溶剂等特点，能直接分离大量粗提样品，分离到的化合物纯度可达98％以上，可以用于黄芪药材及制剂的质量控制。
2.低成本、收率高、重复性好。本发明方法回收率达80％以上，而且所用溶剂系统简单，其洗脱溶剂为普通溶剂，价格便宜，因此是一种经济的提取黄芪异黄酮主要单体组分的方法；可为黄芪中各种异黄酮单体组分的生产提供新工艺。
图1为实施例1中黄芪黄酮粗品的高效液相分析图；图2为实施例1中含芒柄花素、9，10-二甲氧基紫檀烷和2’，7-二羟基-3’，4’-二甲氧基异黄烷的组分Fr2的高效液相分析图；图3为实施例1中芒柄花素、9，10-二甲氧基紫檀烷和2’，7-二羟基-3’，4’-二甲氧基异黄烷的高效液相制备色谱图；图4为实施例1中纯化的化合物(依次为芒柄花素、9，10-二甲氧基紫檀烷和2’，7-二羟基-3’，4’-二甲氧基异黄烷)的高效液相分析图。
下面结合实施例及附图对本发明作进一步说明。
实施例11.称取黄芪总黄酮粗提物浸膏20g(高效液相色谱分析见图1)，加甲醇使其溶解，与硅胶以质量比为1∶2～3(w/w)拌样，拌样均匀后，挥干溶剂，研磨均匀。
2.用100～200目的硅胶(1300g)填充层析柱柱层析，洗脱溶剂为石油醚-乙酸乙酯(体积比为1∶1)以4倍柱体积洗脱。
3.流出部分用薄层色谱检测，展开剂为石油醚-乙酸乙酯(体积比为1∶1)，显色剂为含5％硫酸的甲醇溶液，收集含有目标产物(Rf≥0.62)的馏分，将含有芒柄花素、9，10-二甲氧基紫檀烷和2’，7-二羟基-3’，4’-二甲氧基异黄烷的部分合并为组分Fr2，浓缩成浸膏757mg。组分Fr2的高效液相色谱分析(如图2)。
4.用反相高效液相制备色谱分离组分Fr2。将组分Fr2 92.5mg溶于5mL甲醇-氯仿(体积比为1∶2)溶液体系中，过0.45μm滤膜，作为制备色谱进样溶液。制备色谱柱内径为7.7cm，柱长20cm，柱填料为C18(粒径10μm)，进样环20mL。将样品注入制备色谱的进样环中，用甲醇和含0.5％甲酸的水溶液作洗脱相，两相溶剂以体积分数比为50∶50，以150mL/min的流速进行等度洗脱，运行时间为55min。通过在线的紫外检测器监测流分，检测波长230nm(见图3)，按峰切割并收集流出物，得到芒柄花素31.4mg、9，10-二甲氧基紫檀烷14.8mg、2’，7-二羟基-3’，4’-二甲氧基异黄烷24.3mg。三个化合物的纯度＞98％，回收率＞87％，见图4。
其中芒柄花素、9，10-二甲氧基紫檀烷和2’，7-二羟基-3’，4’-二甲氧基异黄烷的化学结构图如下； 芒柄花素 9，10-二甲氧基紫檀烷 2’，7-二羟基-3’，4’-二甲氧基异黄烷实施例2组分Fr2的制备方式同实施例1。称取组分Fr2 287.5mg溶解于10mL甲醇-氯仿(体积比为1∶2)溶液体系中，过0.45μm滤膜，作为制备色谱进样溶液。制备色谱柱内径为10cm，柱长20cm，柱填料为C18(粒径10μm)，进样20mL。将样品注入制备色谱的进样环中，用甲醇和含0.5％甲酸的水溶液作洗脱相，两相溶剂体积比为50∶50，以300mL/min的流速进行等度洗脱，运行时间55min。通过紫外检测器在线监测流分，检测波长230nm，按峰切割并收集流出物，得到芒柄花素96mg、9，10-二甲氧基紫檀烷41.6mg、2’，7-二羟基-3’，4’-二甲氧基异黄烷68.2mg。三个化合物的纯度＞98％，收率大于80％。
实施例3
组分Fr2的制备方式同实施例1。称取组分Fr2 11mg溶解于5mL甲醇-氯仿(体积比为1∶2)溶液体系中，过0.45μm滤膜，作为制备色谱进样溶液。制备色谱柱内径为2cm，柱长25cm，柱填料为C18(粒径10μm)，进样环10mL。将样品注入制备色谱的进样环中，以甲醇和含0.5％甲酸的水溶液作洗脱相，两相溶剂以体积分数为50∶50进行等度洗脱，流速为19mL/min，运行时间55min。通过在线的紫外检测器监测流分，检测波长230nm，按峰切割并收集流出物，得到芒柄花素3.9mg、9，10-二甲氧基紫檀烷1.76mg、2’，7-二羟基-3’，4’-二甲氧基异黄烷2.84mg。三个化合物的纯度纯度＞98％，收率大于85％。
为了确认所得产物，对上述结晶粉末进行了薄层色谱和质谱鉴定，并与标准品对照。
采用硅胶G F254薄层板分别对各产物定性检测，并与对照品Rf值比较。
质谱分析结果说明所得产物的分子量分别为430、300、302，这些数据相应与对照品的分子量一致。
权利要求
1.一种黄芪中多种异黄酮成分的分离制备方法，其特征在于采用硅胶层析柱对含有黄芪异黄酮的植物提取物进行富集浓缩后，再通过反相高效液相制备色谱进行分离制备。
2.根据权利要求
1所述黄芪中多种异黄酮成分的分离制备方法，其特征在于1)先用硅胶层析柱对含有黄芪异黄酮的提取物进行目标成分的富集浓缩；所使用的洗脱剂为石油醚-乙酸乙酯，它们的体积比为1∶1～1.5；2)流出部分用薄层色谱检测，薄层在紫外灯下检出荧光，展开剂为石油醚-乙酸乙酯，它们的体积比为1∶1～1.5；将含有的目标产物Rf≥0.62部分合并，浓缩成浸膏后；3)用甲醇-氯仿溶液体系溶解，甲醇-氯仿的体积比为1∶2～3，过滤膜，用高效液相制备色谱对其进行分离、纯化而得到芒柄花素、9，10-二甲氧基紫檀烷和2’，7-二羟基-3’，4’-二甲氧基异黄烷三个化合物的纯品。
3.根据权利要求
2所述黄芪中多种异黄酮成分的分离制备方法，其特征在于所述步骤1)的具体过程为，将黄芪总黄酮粗提物用甲醇溶解，与硅胶拌样，样品与硅胶的质量比为1∶2～3，拌样均匀后，挥干溶剂，研磨均匀，用硅胶填充层析柱进行柱层析。
4.根据权利要求
2所述黄芪中多种异黄酮成分的分离制备方法，其特征在于所述步骤3)中高效液相制备色谱是反相高效液相制备色谱，填充材料为反相硅胶C18，粒径5～10μm。
5.根据权利要求
2所述黄芪中多种异黄酮成分的分离制备方法，其特征在于所述步骤3)中高效液相制备色谱进行分离制备的流动相为甲醇和含甲酸的水溶液两相体系，添加甲酸浓度范围为0.1～0.5％；两相溶剂以体积分数比为45∶55～55∶45进行洗脱。
6.根据权利要求
2所述黄芪中多种异黄酮成分的分离制备方法，其特征在于所述步骤3)中高效液相制备色谱进行分离制备流速为19～300ml/min。
7.根据权利要求
2所述黄芪中多种异黄酮成分的分离制备方法，其特征在于所述步骤3)中所用的滤膜0.2～0.5μm。
8.根据权利要求
2所述黄芪中多种异黄酮成分的分离制备方法，其特征在于所述步骤1)中柱层析所用石油醚的沸点范围为60～90℃，硅胶为100～200目。
专利摘要
本发明涉及黄芪中多种异黄酮成分的分离制备方法。本方法分为两步①采用硅胶柱富集含有黄芪异黄酮的植物提取物；②利用反相高效液相制备色谱对目标成分进行分离制备。本制备方法具有低成本、收率高、重复性好等优点，可为黄芪中各种异黄酮单体组分的生产提供新工艺。
文档编号C07D493/00GK1990483SQ200510136731
公开日2007年7月4日 申请日期2005年12月28日
发明者张曦, 肖红斌, 梁鑫淼 申请人:中国科学院大连化学物理研究所导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan