专利名称:一种大黄鱼精子遗传物质完全失活的方法
技术领域：
本发明涉及海水鱼类染色体操作技术，具体地说是一种我国重要海水养殖对象-大黄鱼精子遗传物质完全灭活的方法。
背景技术：
精子遗传物质的完全灭活是与受精卵第二极体和第一次卵裂抑制技术结合产生同质和异质雌核发育二倍体的关键技术。虽然目前已经具有海水鱼类精子紫外遗传失活的方法，但主要是针对牙鲆鱼的，而大黄鱼精子的特点与牙鲆鱼精子的完全不同，其精液浓度、pH适合范围以及精子内部超微结构与后者的有较大差别，使得大黄鱼精子对紫外照射的敏感性和耐受力也存在很大差异。将牙鲆等鲆鲽鱼类精子遗传失活条件直接应用于大黄鱼精子的遗传失活中一直未获得成功，其遗传失活率只有88-92％；而有关于大黄鱼精子完全遗传失活的方法实验的报道也尚未见到。
发明内容为了克服现有技术对大黄鱼精子遗传物质灭活中存在的问题，本发明的目的在于提供一种灭活效果完全的适用于大黄鱼精子遗传物质失活的紫外照射方法和优化参数、以避免大黄鱼雌核发育二倍体诱导可能带来分析结果混乱情形的大黄鱼精子遗传物质失活的方法。
为了实现上述目的，本发明的技术方案如下灭活步骤为①精液保存将人工挤出的未激活的大黄鱼成熟情液避光保存于2～4℃低温条件下备用。
②精液稀释采用预冷的稀释液稀释所述大黄鱼成熟精液，稀释倍数为20～100倍，然后将稀释后的大黄鱼成熟精液放入到已预冷到0～5℃的培养皿中，其培养皿中稀释后的大黄鱼成熟精液液体厚度为0.1～0.3cm；其中按重量体积百分比计所述预冷的稀释液成份为NaCl 0.60～0.80％，KCl 0.03～0.05％，CaCl20.01～0.03％，葡萄糖0.05～0.10％；pH7.0～7.3；预冷温度为0～5℃。
③精子遗传物质失活紫外光源预热5～10min后，将带有稀释后的大黄鱼成熟精液的培养皿置于紫外光源下，照射1.5～5min，使得大黄鱼遗传物质失活；其中紫外光源与培养皿底部距离恒定为15cm，紫外光源的照射剂量为1800～6000erg/mm2；所述紫外光源的照射剂量用Cole-Parmer Instrument Company的VLX-3W数字紫外辐射照度计测定。
④失活效果检测将照射后的精子与正常大黄鱼卵子受精，根据受精后6h胚胎存活率、孵化率和单倍率获得率，对遗传物质失活效果进行检测。
各步骤中的优选参数为采用预冷的稀释液稀释所述大黄鱼成熟精液，其稀释倍数为40～80倍；培养皿中稀释后的大黄鱼成熟精液液体厚度为0.1～0.25cm；稀释液与培养皿都预冷到0～2℃；紫外照射强度剂量为3000～4200erg/mm2；照射时间为2.5～3.5min。
本发明原理是当紫外照射强度达到一定剂量时，不仅将精子的遗传物质完全灭活，也同时保证精子的受精能力，并可以使卵子正常启动。
本发明的优点和积极效果在于1.本发明方法简单，所需设备少，便于操作，解决了大黄鱼雌核发育诱导过程中最关键的精子遗传物质灭活不彻底的问题。
2.利用本发明不仅可使大黄鱼精子遗传物质失活率达到100％，且精子仍具有活力可以正常启动卵子发育，同时还保证了灭活后精子对卵子较高的启动率(80～90％)及其受精后较高的6h胚胎存活率(75～85％)和孵化率(60～70％)。
3.本发明用于大黄鱼异质雌核发育诱导实验中已获得了良好的实验结果，保证了诱导后的个体全部为雌核发育的后代。对于进行大规模大黄鱼异质雌核发育和全雌大黄鱼诱导及其应用于实际养殖生产提供了技术基础。
4.适用范围较广，本发明不仅适用于大黄鱼异质雌核发育的诱导，也适用于大黄鱼同质雌核发育的诱导，这也将为大黄鱼纯系的建立提供基本参数和基础。其技术方案和其中的一些处理参数也适用于其它非鲆鲽类的海水鱼的雌核发育诱导。
图1(a)为本发明实施例1获得的大黄鱼雌核发育单倍体的初孵仔鱼图。
图1(b)为本发明实施例1大黄鱼二倍体的初孵仔鱼图。
图2(a)为本发明实施例2获得的大黄鱼雌核发育单倍体初孵仔鱼的细胞流仪检测图。
图2(b)为本发明实施例2大黄鱼二倍体初孵仔鱼的细胞流仪检测图。
具体实施方式下面结合附图和实施例详述本发明。
实施例1灭活步骤为1.精液保存将人工挤出的未激活的大黄鱼成熟精液避光保存于2℃低温条件下备用。
2.精液稀释采用预冷的稀释液稀释所述的大黄鱼成熟精液，其稀释倍数为40倍，然后将稀释后的大黄鱼成熟精液放入到已预冷到0℃的培养皿中，培养皿中稀释后的大黄鱼成熟精液液体厚度为0.1cm。
其中预冷的稀释液为按重量体积百分比计NaCl 0.60％；KCl 0.03％；CaCl20.01％；葡萄糖0.05％；pH7.0；稀释液预冷到0℃。
3.精子遗传物质失活打开紫外光源预热5min后，将带有稀释后的大黄鱼成熟精液的培养皿置于紫外光源下，保持紫外光源与培养皿底部距离为15cm，照射2.5min，其紫外光源照射剂量为3000erg/mm2，所述紫外照射剂量用Cole-Parmer InstrumentCompany的VLX-3W数字紫外辐射照度计测定。
4.失活效果检测将照射后的大黄鱼精子与正常大黄鱼卵子受精，采用外部形态观察和流式细胞仪检测细胞中DNA相对含量对遗传物质失活效果进行鉴定。从形态学上观察，遗传物质完全失活的精子与卵子受精孵化后全部为单倍体，表现出单倍体综合症(参见图1)。
实施例2与实施例1不同之处在于1.精液保存将人工挤出的未激活的大黄鱼成熟精液避光保存于3℃低温条件下备用。
2.精液稀释采用预冷的稀释液稀释所述的大黄鱼成熟精液，其稀释倍数为50倍，然后将稀释后的大黄鱼成熟精液放入到已预冷到1℃的培养皿中，培养皿中稀释后的大黄鱼成熟精液液体厚度为0.2cm；其中预冷的稀释液为按重量体积百分比计NaCl 0.75％，KCl 0.04％，CaCl20.02％，葡萄糖0.08％；pH7.2；稀释液预冷到1℃。
3.精子遗传物质失活打开紫外光源预热8min后，将带有稀释后的大黄鱼成熟精液的培养皿置于紫外光源下，保持紫外光源与培养皿底部距离为15cm，照射3min，其紫外光源照射剂量为3600erg/mm2。
4.失活效果检测将照射后的大黄鱼精子与正常大黄鱼卵子受精，采用外部形态观察和流式细胞仪检测DNA相对含量对遗传物质失活效果进行鉴定。遗传物质完全失活的精子与卵子受精孵化后全部为单倍体，其细胞内DNA含量也只有正常二倍体的一半(参见图2)。
实施例3与实施例1不同之处在于1.精液保存将人工挤出的未激活的大黄鱼成熟精液避光保存于4℃低温条件下备用。
2.精液稀释采用预冷的稀释液稀释所述的大黄鱼成熟精液，其稀释倍数为80倍，然后将稀释后的大黄鱼成熟精液放入到已预冷到2℃的培养皿中，培养皿中稀释后的大黄鱼成熟精液液体厚度为0.25cm；其中预冷的稀释液为按重量体积百分比计，NaCl 0.80％，KCl 0.05％，CaCl20.03％，葡萄糖0.10％；pH7.3；稀释液预冷到2℃。
3.精子遗传物质失活打开紫外光源预热10min后，将带有稀释后的大黄鱼成熟精液的培养皿置于紫外光源下，保持紫外光源与培养皿底部距离为15cm，照射3.5min，其紫外光源照射剂量为4200erg/mm2。
4.失活效果检测将照射后的大黄鱼精子与正常大黄鱼卵子受精，采用外部形态观察和流式细胞仪检测DNA相对含量对遗传物质失活效果进行鉴定。遗传物质完全失活的精子与卵子受精孵化后全部为单倍体，表现出单倍体综合症，其DNA含量也只有正常二倍体的一半。
权利要求
1.一种大黄鱼精子遗传物质完全灭活的方法，包括精液保存、精液稀释、精子遗传物质失活，其特征在于①精液保存将人工挤出的未激活的大黄鱼成熟精液避光保存于2～4℃低温条件下备用；②精液稀释采用预冷的稀释液稀释所述大黄鱼成熟精液，稀释倍数为20～100倍，然后将稀释后的大黄鱼成熟精液放入已预冷到0～5℃的培养皿中，其培养皿中稀释后的大黄鱼成熟精液液体厚度为0.1～0.3cm；其中按重量体积百分比计所述预冷的稀释液成份为NaCl 0.60～0.80％，KCl 0.03～0.05％，CaCl2，0.01～0.03％，葡萄糖0.05～0.10％；pH，7.0～7.3；稀释液预冷到0～5℃；③精子遗传物质失活紫外光源预热5～10min后，将带有稀释后的大黄鱼成熟精液的培养皿置于紫外光源下，照射1.5～5min，使得大黄鱼遗传物质失活；其中紫外光源的照射剂量为1800～6000erg/mm2。
2.按照权利要求
1所述大黄鱼精子遗传物质灭活的方法，其特征在于精子遗传物质失活时所述紫外光源与培养皿底部距离恒定为15cm。
3.按照权利要求
1所述大黄鱼精子遗传物质灭活的方法，其特征在于采用预冷的稀释液稀释所述大黄鱼成熟精液，其稀释倍数为40～80倍；培养皿中稀释的大黄鱼成熟精液液体厚度为0.1～0.25cm；稀释液与培养皿都预冷到0～2℃；紫外照射强度剂量为3000～4200erg/mm2；照射时间为2.5～3.5min。
专利摘要
本发明公开一种适用于大黄鱼精子遗传物质完全失活的方法，可以用于大黄鱼雌核发育和其全雌苗种诱导的研究和生产。方法为采用预冷的含有营养成分的稀释液将大黄鱼成熟精液稀释20～100倍后放于平底培养皿中，用紫外光源照射后，与大黄鱼卵子受精并孵育，而后对精子遗传灭活的效果进行鉴定。本发明具有方法简单，所需设备少，便于操作，精子遗传物质灭活率能够达到100％，且精子仍具有活力可以正常启动卵子发育等优点。为实现大规模雌核发育和全雌大黄鱼诱导奠定了基础。
文档编号C12N15/01GK1990857SQ200510136709
公开日2007年7月4日 申请日期2005年12月27日
发明者许建和, 尤锋, 张培军, 吴雄飞, 徐永立, 蒋宏雷 申请人:中国科学院海洋研究所导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan