专利名称:一种聚合血红蛋白修饰方法
技术领域：
:本发明涉及生物医药领域，特别是一种聚合血红蛋白修饰方法。
背景技术：
以输入全血为主要手段的传统输血方式在医疗救护方面发挥了极为重要的作用，但同时其自身也存在难以克服的各种缺点，主要表现在输入前需进行交叉配型、存在多种病毒交叉感染的危险、血源紧张、贮存期较短且需要特殊的设施。为了解决上述矛盾，人们早在19世纪末就开始了有关红细胞代用品的研究。红细胞代用品是指具有扩充血容积、维持血管内外渗透压平衡并且有载氧功能，用以代替人红细胞的各种氧载体的总称。血液代用品的研制经历了从最初无载氧功能的血管扩容剂，如高渗盐溶液、羟乙基淀粉溶液、明胶等到目前具有携氧功能的各种载体溶液。目前正在研制的各类产品与全血比较具有诸多优点，如来源广泛、安全洁净、可长期保存、输入人体前无需进行交叉配型，特别适用于战争、自然灾害、以及其他突发事件中大量出血病人的急救。血红蛋白是人体内的物质，它的溶液作为红细胞代用品比化学合成物质更具优越性。但是，未经修饰的血红蛋白溶液也存在一些问题，如一是未经修饰的血红蛋白在体内由四聚体裂解为二聚体和单体并从肾脏滤过，形成血红蛋白尿，造成肾损害；二是在血红蛋白的提取过程中，由于2，3-二磷酸甘油酸(2，3-DPG)的丢失，使血红蛋白的氧结合力提高，不利于向组织有效供氧；三是未修饰的血红蛋白在血浆中胶体渗透压较高，而且循环半衰期短。
以血红蛋白为基础的血液代替品的研究主要集中于延长循环半衰期、降低氧结合力和稳定四聚体结构等方面。通常采用交联、聚合、脂质体包埋和化学修饰等方法或将几种方法结合在一起达到此目的。美国Northfield公司用5‘-磷酸吡哆醛(PLP)修饰后，用戊二醛聚合的产品已经进入III期临床实验。Shirley L.等人，在HemoglobinPolymerization，Methods in enzymology，V(231)，287-308，中指出交联聚合会使血红蛋白对氧结合力大大提高，而修饰则会降低氧结合力，所以终产品对氧的结合力将是这两种作用平衡之后的结果。
在体内，2，3-DPG显著影响血红蛋白对氧的结合力。血红蛋白结合2，3-DPG后O2的结合力降低，氧结合曲线右移，P50增至26mmHg以上。红细胞内的2，3-DPG有着重要的生理意义，对血红蛋白的运O2有重要贡献，血红蛋白对O2的结合力与红细胞内的2，3-DPG浓度成反比，因而，红细胞中2，3-DPG浓度愈高，血液流经组织毛细血管时释放的O2量也愈多，结合O2能力降低反而有利于输送O2，人体可通过红细胞中2，3-DPG浓度改变来调节组织的获氧量，这对人体在某些缺氧情况下的代偿有重要意义。
在体外，在纯化过程中2，3-DPG大量丢失，而且聚合过程也会使血红蛋白对氧结合力大大增加，采用PLP化学修饰血红蛋白是解决2，3-DPG丢失、氧结合增加的方法之一，从四十年代到现在已经发展了几十年。目前已发现并合成了许多修饰交联剂和方法，磷酸吡哆醛(PLP)是其中的一种，它是2，3-DPG的类似物，可以与血红蛋白β-亚基N-末端的缬氨酸(Val)反应生成希夫碱，降低血红蛋白的结合力，提高了血红蛋白的P50。
5‘-磷酸吡哆醛(PLP)可与Hb的亚基N末端的缬氨酸发生羟醛缩合生成亚胺，再经NaBH4还原生成胺键。反应如图1。
据报道，PLP修饰无基质纯化血红蛋白后，可将其P50从10-12mmHg提高到30-32mmHg，这说明用PLP修饰后可降低血红蛋白的氧结合力，提高其P50，恢复其给组织供氧的能力。但所查阅文献中对血红蛋白的PLP修饰都放在聚合步骤之前(前修饰)，无人尝试过将修饰步骤放在聚合步骤之后(后修饰)。由于PLP售价很高，前修饰比后修饰用量大5-10倍左右，因此在保证血红蛋白对氧的结合力的条件下改进工艺，将会节省成本，具有很大的经济效益。
发明内容
本发明的目的在于提供一种聚合血红蛋白修饰方法，它针对上述情况，发明一种操作简便、成本低廉、高效的修饰工艺。
本发明的技术方案一种聚合血红蛋白修饰方法，其特征在于它包括以下步骤(1)在0～4℃条件下，以天然红细胞为原料得到纯化血红蛋白，在通氮及加还原剂保护下，先经同型双功能试剂进行聚合，再用修饰剂进行修饰；(2)加入修饰剂后加入谷胱甘肽等还原剂防止高铁血红蛋白生成。
上述步骤(1)中制备所用的原料天然红细胞来源为人胎盘血或过期的库存人血。
上述步骤(1)中先对纯化血红蛋白进行聚合，所用双功能试剂为戊二醛。
上述步骤(1)中对聚合后血红蛋白进行修饰，所用修饰剂为5’-磷酸吡哆醛(PLP)。
上述步骤(1)中5’-磷酸吡哆醛与血红蛋白的摩尔比为4-8∶1。
上述步骤(2)中，加入5’-磷酸吡哆醛反应0.5-1.5小时之后，再加入谷胱甘肽。
上述步骤(2)中，加入谷胱甘肽浓度为2％。
上述步骤(2)中，加入谷胱甘肽终浓度按重量/体积比为0.1～0.5％。
本发明的工作原理为通过对比研究血红蛋白先用PLP修饰后聚合，以及先聚合后PLP修饰两种工艺所得产品的P50，从而找出一种合适的修饰工艺。而且，在此过程中加入还原剂以抑制高铁血红蛋白的生成，但还原剂的加入顺序也会显著影响PLP的修饰效果。
本发明的技术效果在于在优选合适修饰工艺上做了大量研究，结果表明，前修饰与后修饰P50分别为13.80mmHg和15.07mmHg，无显著差别，但PLP用量后者比前者少5-10倍。谷胱甘肽等还原物质在PLP之前加入及之后加入P50分别为14.50mmHg和22.11mmHg，两种加入方式高铁血红蛋白含量分别为6.8％和6.6％，而在修饰前高铁血红蛋白含量分别为7.8％和8.0％，可以看出，在加入PLP之前和之后加入还原物质对高铁无显著影响，但后加入组P50显著提高。因此，在总结大量实验结果的基础上，我们提出将PLP修饰放于聚合之后，而且在加入PLP之后将防止高铁生成的还原物质加入，这样既能控制高铁血红蛋白的生成，又能保证P50值在合适范围，而且能大大降低生产成本。
图1为5‘-磷酸吡哆醛(PLP)可与Hb的亚基N末端的缬氨酸发生羟醛缩合生成亚胺，再经NaBH4还原生成胺键的图示。
具体实施方式
以下将通过具体实施方式
的形式再对本发明的上述内容做进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅局限于以下的具体实施方式
，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
实施例1PLP前修饰和后修饰I将从胎盘血(或成人外周血)中纯化出的血红蛋白，在0～4℃的低温条件下，通入不含氧的高纯氮等惰性气体，流量为每分钟1～5L，持续15～30分钟，并按10万～100万单位/1000毫升量加入青霉素和/或链霉素等常规抑菌药物并充分混合均匀；将PLP用1M的Tris-Hcl溶解，浓度为2％，PH＝7.3-7.4，按与血红蛋白摩尔比4∶1-8∶1加入，继续通高纯氮等惰性气体反应0.5-1.5小时后，按重量/体积比为0.1～0.5％加入2％浓度的谷胱甘肽作为抗氧化剂，再通高纯氮等惰性气体反应1-2小时后，按与血红蛋白摩尔比20∶1-80∶1加入1.56％NaBH4(溶解于10-3M氢氧化钠)终止，反应3-6个小时。再将血红蛋白溶液以截留分子量为10KD的超滤膜按常规方式进行超滤处理，使浓度至4-6g/dl，0.22um除菌过滤。按5-9∶1加入1％的戊二醛，通氮反应0.5小时，用10-15倍体积等渗PBS(PH＝7.3-7.4)进行以截留分子量为100KD的超滤膜按常规方式进行超滤处理，浓缩至10-12g/dl，按与血红蛋白摩尔比20∶1-80∶1加入1.56％NaBH4(溶解于10-3M氢氧化钠)终止，反应3-6个小时。再将血红蛋白溶液以截留分子量为100KD的超滤膜按常规方式进行超滤处理，使浓度至4-6g/dl，0.22um除菌过滤，取样进行P50检测。
II将从胎盘血(或成人外周血)中纯化出的血红蛋白，在0～4℃的低温条件下，通入不含氧的高纯氮等惰性气体，流量为每分钟1～5L，持续15～30分钟，并按10万～100万单位/1000毫升的量加入青霉素和/或链霉素等常规抑菌药物并充分混合均匀，再通高纯氮等惰性气体0.5-1小时。按5-9∶1加入1％的戊二醛，通氮反应0.5小时，用10-15倍体积等渗PBS(PH＝7.3-7.4)进行以截留分子量为100KD的超滤膜按常规方式进行超滤处理，浓缩至10-12g/dl，按与血红蛋白摩尔比20∶1-80∶1加入1.56％NaBH4(溶解于10-3M氢氧化钠)终止，反应3-6个小时。再将血红蛋白溶液以截留分子量为100KD的超滤膜按常规方式进行超滤处理，浓缩至8-10g/dl，0.22um除菌过滤。将PLP用1M的Tris-Hcl溶解，浓度为2％，PH＝7.3-7.4，按与血红蛋白摩尔比4∶1-8∶1加入，继续通高纯氮等惰性气体反应1-2小时后，按重量/体积比为0.1～0.5％加入2％浓度的谷胱甘肽作为抗氧化剂，再通高纯氮等惰性气体反应1-2小时后，按与血红蛋白摩尔比20∶1-80∶1加入1.56％NaBH4(溶解于10-3M氢氧化钠)终止，反应3-6个小时。再将血红蛋白溶液以截留分子量为100KD的超滤膜按常规方式进行超滤处理，使浓度至4-6g/dl，0.22um除菌过滤。取样进行P50检测。
实施例2谷胱甘肽的加入顺序I将从胎盘血(或成人外周血)中纯化出的血红蛋白，在0～4℃的低温条件下，通入不含氧的高纯氮等惰性气体，流量为每分钟1～5L，持续15～30分钟，按10万～100万单位/1000毫升的量加入青霉素和/或链霉素等常规抑菌药物并充分混合均匀，再通高纯氮等惰性气体0.5-1小时按重量/体积比为0.1～0.5％加入2％浓度的谷胱甘肽作为抗氧化剂。将PLP用1M的Tris-HCl溶解，浓度为2％，PH＝7.3-7.4，按与血红蛋白摩尔比4∶1-8∶1加入，继续通高纯氮等惰性气体反应2-3小时。按与血红蛋白摩尔比20∶1-80∶1加入1.56％NaBH4(溶解于10-3M氢氧化钠)终止反应3-6个小时。再将血红蛋白溶液以截留分子量为10KD的超滤膜按常规方式进行超滤处理，浓缩至8-10g/dl，0.22um除菌过滤，取样进行P50检测。
II将从胎盘血(或成人外周血)中纯化出的血红蛋白，在0～4℃的低温条件下，通入不含氧的高纯氮等惰性气体，流量为每分钟1～5L，持续15～30分钟，并按10万～100万单位/1000毫升的量加入青霉素和/或链霉素等常规抑菌药物并充分混合均匀，再通高纯氮等惰性气体0.5-1小时。将PLP用1M的Tris-Hcl溶解，浓度为2％，PH＝7.3-7.4，按与血红蛋白摩尔比4∶1-8∶1加入，继续通高纯氮等惰性气体反应1-2小时后，按重量/体积比为0.1～0.5％加入2％的谷胱甘肽作为抗氧化剂，再通高纯氮等惰性气体反应1-2小时后，按与血红蛋白摩尔比20∶1-80∶1加入1.56％NaBH4(溶解于10-3M氢氧化钠)终止，反应3-6个小时。再将血红蛋白溶液以截留分子量为10KD的超滤膜按常规方式进行超滤处理，浓缩至8-10g/dl，0.22um除菌过滤，取样进行P50检测。
由上述方法制备的血红蛋白P50检测结果如表1所示。
表1 血红蛋白P50检测结果
权利要求
1.一种用于聚合血红蛋白修饰的方法，其特征在于它包括以下步骤(1)在0～4℃条件下，以天然红细胞为原料得到纯化血红蛋白，在通氮及加还原剂保护下，先经同型双功能试剂进行聚合，再用修饰剂进行修饰；(2)加入修饰剂后，加入谷胱甘肽等还原剂防止高铁血红蛋白生成。
2.根据权利要求
1所述的一种聚合血红蛋白修饰方法，其特征在于制备所用的原料天然红细胞来源为人胎盘血或过期的库存人血。
3.根据权利要求
1所述的一种聚合血红蛋白修饰方法，其特征在于先对纯化血红蛋白进行聚合，所用双功能试剂为戊二醛。
4.根据权利要求
1所述的一种聚合血红蛋白修饰方法，其特征在于对聚合后血红蛋白进行修饰，所用修饰剂为5’-磷酸吡哆醛。
5.根据权利要求
1所述的一种聚合血红蛋白修饰方法，其特征在于在加入5’-磷酸吡哆醛之后再加入谷胱甘肽等还原剂。
6.根据权利要求
4所述的一种聚合血红蛋白修饰方法，其特征在于PLP与血红蛋白的摩尔比为4-8∶1。
7.根据权利要求
5所述的一种聚合血红蛋白修饰方法，其特征在于在加入5’-磷酸吡哆醛反应0.5-1.5小时之后再加入谷胱甘肽。
8.根据权利要求
5所述的一种聚合血红蛋白修饰方法，其特征在于加入谷胱甘肽终浓度按重量/体积比为0.1～0.5％。
专利摘要
本发明涉及的是用于聚合血红蛋白的修饰方法，其特征在于在0～4℃及通氮等条件下，由天然红细胞得到纯化血红蛋白，将其先经同型双功能试剂聚合，再用5’－磷酸吡哆醛修饰。修饰过程中，谷胱甘肽应在加入PLP之后0.5－1.5小时之后加入。此工艺既能控制高铁血红蛋白的生成，又能保证P
文档编号A61P7/08GK1990039SQ200510136023
公开日2007年7月4日 申请日期2005年12月28日
发明者杨成民, 李凤娟, 张鸿辉, 梁伟光, 李洪英, 许丽丽, 李燊, 王劲峰, 杨晓明 申请人:天津协和生物科技发展有限公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan