一种鉴定猪耳面积大小的方法及其专用试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种鉴定猪耳面积大小的方法及其专用试剂盒，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 我国养猪的历史可谓悠久，鉴于大耳文化的熏陶，我国很多地方猪品种多数都具 有一双大耳，尤其以太湖猪为甚。受不同地域耳文化的影响，不同地域对猪耳大小的选择方 向性存在巨大差异，于是就出现了不同猪种猪耳大小和形态的丰富多样性。甚至对于一些 地方猪品种如大耳的二花脸猪、东北民猪和小耳的滇南小耳猪、广东小耳花猪等，耳大小已 经成为了其品种特异性标志之一。
[0003] 猪耳面积性状QTL定位及主效基因研宄已经在国内外研宄中开展。英国罗斯 林研宄所研宄人员利用大白猪X梅山猪F2设计资源群体，耳面积性状显著QTL分别 被定位于5号染色体上51cM和7号染色体上70cM处（Wei WH, de Koning DJ, Penman JC，Finlayson HA，Archibald AL, Haley CS:QTL modulating ear size and erectness in pigs.Anim Genet 2007,38:222-226.)。另外，江西农业大学研究人员利用白色杜洛克X 二花脸F2设计资源群体开展了耳面积性状QTL定位研究，分别将QTL定位于5号染色体 上 70cM 和 7 号染色体上 58cM 处（Ma J，Qi W，Ren D，Duan Y，Qiao R，Guo Y，Yang Z，Li L，Milan D，Ren J，Huang LA genome scan for quantitative trait loci affecting three ear traits in a White DurocXChinese Erhualian resource population. Anim Genet 2009,40:463-467.)，且这两个QTL分别可以解释45%和17%的表型变异。其中， 在5号染色体上耳面积性状QTL区间内存在一个LEMD3(LEM domain containing 3)基 因，该基因编码的LEMD3蛋白是核内在膜蛋白，可通过蛋白羧基末端的结构域与Smad蛋 白家族中Smad2及Smad3结合，抑制抗转化生长因子-β (TGF-β)以及骨形态发生蛋 白（BMP)信号通路的活性，从而影响骨的正常发育。LEMD3基因也是导致人类三种骨密 度异常疾病：脆弱性骨硬化症（osteopoikilosis)、科斯综合症（Buschke-Ollendorff syndrome)和局限性吝状过骨症（melorheostosis)的因果基因 （Bourgeois B，Gilquin BjTellier-Lebegue Cj OstlundCjWu Wj et al. (2013) Inhibition of TGF-β signaling at the nuclear envelope:characterization of interactions between MANlj Smad2and Smad3, and PPM1A. Sci Signal 6(280) :ra49. ；HeIlemans J，Preobrazhenska 0,Willaert A，et al. Loss-of-function mutations in LEMD3result in osteopoikilosis, Buschk e-Ollendorff syndrome and melorheostosis.Nat Genet,2004,36 (II):1213-1218.； Ben-Asher Ej Zelzer E，Lancet D. LEMD3: the gene responsible for bone density disorders (osteopoikilosis) .Isr Med Assoc J，2005Apr;7 (4) :273-4.) D 综合上述研究， LEMD3基因可作为耳面积性状主效候选基因，具有很高研究价值。
[0004] 单碱基延伸（SBE)是SNP分型的常用技术，也被成功应用于SNP芯片技术中，该技 术是以普通多重PCR产物为模版，针对SNP位点进行单碱基延伸。每个SNP位点设计一条 SBE引物，延伸碱基为SNP位点，在整个反应体系中需加入单碱基延伸酶和两种不同类型荧 光所标记的ddNTP，延伸一个碱基即可终止延伸反应，以达到单碱基延伸的目的。SNP位点 信号通过2次PCR得到了有效放大，检测的灵敏度模板DNA可达到lng，目前已成为了一种 对SNP序列特异性要求低、灵敏度高、操作简单的SNP分型芯片技术。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种鉴定猪耳面积大小的方法及其专用试剂盒。
[0006] 本发明提供一种鉴定或辅助鉴定猪的耳面积大小的方法，包括如下步骤：检测待 测猪的基因型，根据所述猪的基因型确定猪耳面积大小：纯合AA基因型的猪的耳面积大于 纯合CC基因型的猪的耳面积；
[0007] 所述纯合AA基因型的猪为g. 942A>C多态性位点的碱基均为A的猪；
[0008] 所述纯合CC基因型的猪为g. 942A>C多态性位点的碱基均为C的猪；
[0009] 所述 g. 942A>C 多态性位点为 GenBank Accession Number 为 NC_010447. 4 的序列 的自5'末端起第942位；
[0010] 所述 GenBank Accession Number 为 NC_010447. 4 的序列的更新日为 2013 年 9 月 29臼。
[0011] 上述方法中，所述纯合AA基因型或所述纯合CC基因型的判定方法为如下（1)-(3) 任一所示：
[0012] (1)以待测猪的基因组DNA为模板，以SEQ ID No. 1所示的DNA分子和SEQ ID No. 2 所示的DNA分子为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；如果所述PCR扩增产物自5'末 端起第68位的碱基均为A，则所述猪的基因型为纯合AA基因型，如果所述PCR扩增产物自 5'末端起第68位的碱基均为C，则所述猪的基因型为纯合CC基因型；
[0013] (2)以待测猪的基因组DNA为模板，以SEQ ID No. 1所示的DNA分子和SEQ ID No. 2 所示的DNA分子为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；再以所述PCR扩增产物为模板， 以SEQ ID No. 3所示的DNA分子作为单碱基延伸引物，得到单碱基延伸产物；如果所述单碱 基延伸产物均为SEQ ID No. 6所示的DNA分子，则所述猪的基因型为纯合AA基因型，如果 所述单碱基延伸产物均为SEQ ID No. 7所示的DNA分子，则所述猪的基因型为纯合CC基因 型；
[0014] (3)以待测猪的基因组DNA为模板，以SEQ ID No. 1所示的DNA分子和SEQ ID No. 2所示的DNA分子为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；再以PCR扩增产物为模板， 以SEQ ID No. 3所示的DNA分子作为单碱基延伸引物，得到单碱基延伸产物；将所述单碱基 延伸产物进行基质辅助激光解析电离飞行时间质谱分析，如果所述单碱基延伸产物仅为质 量是4751Da的DNA分子，则所述猪的基因型为纯合AA基因型，如果所述单碱基延伸产物仅 为质量是4711. IDa的DNA分子，则所述猪的基因型为纯合CC基因型；
[0015] 所述单碱基延伸产物为所述单碱基延伸引物延伸一个碱基后得到的单链。
[0016] -种选育耳面积大或耳面积小的猪的方法也属于本发明的保护范围，包括选择纯 合AA基因型的猪进行选育育成耳面积大的猪，或选择纯合CC基因型的猪进行选育育成耳 面积小的猪；
[0017] 所述纯合AA基因型的猪为g.942A>C多态性位点的碱基均为A的猪；
[0018] 所述纯合CC基因型的猪为g. 942A>C多态性位点的碱基均为C的猪；
[0019] 所述 g. 942A>C 多态性位点为 GenBank Accession Number 为 NC_010447. 4 的序列 的自5'末端起第942位；
[0020] 所述 GenBank Accession Number 为 NC_010447. 4 的序列的更新日为 2013 年 9 月 29臼。
[0021] 上述方法中，所述纯合AA基因型或所述纯合CC基因型的判定方法如上述方法。
[0022] -种扩增含有g. 942A>C多态性位点的DNA片段的引物对也属于本发明的保护范 围；
[0023] 所述 g. 942A>C 多态性位点为 GenBank Accession Number 为 NC_010447. 4 的序列 的自5'末端起第942位；
[0024] 所述 GenBank Accession Number 为 NC_010447. 4 的序列的更新日为 2013 年 9 月 29臼。
[0025] 上述引物对中，所述引物对由SEQ ID No. 1所示的DN