r>[0013] 图4是用pA-Rluc、pA-Fluc重组质粒与亲本质粒pHuN4-Fl 12转染细胞后出现的 细胞病变结果。
[0014] 图5是拯救的突变病毒的N蛋白的免疫荧光照片，其中，5a是vHuN4-F112的N蛋 白免疫荧光照片；5b是被拯救病毒vA-Rluc P10代的N蛋白免疫荧光照片；5c是被拯救病 毒vA-Fluc P10代的N蛋白免疫荧光照片；5d为阴性对照。
[0015] 图6是对拯救的重组病毒株vA-Rluc和vA-Fluc与亲本病毒vHuN4-Fl 12滴度比 较结果，生长曲线的描绘。
[0016] 图7是拯救的重组病毒vA-Rluc和vA-Fluc与亲本病毒vHuN4-Fl 12的空斑形态 学比较。
[0017] 图8是P2-P10代的嵌合重组病毒vA-Rluc、vA-Fluc和vHuN4-F112用相同的M0I 感染MARC-145细胞后60小时测定的荧光素酶活性值水平变化图。
[0018] 图9是P5和P10代的嵌合重组病毒vA-Rluc、vA-Fluc各选取10个空斑感染 MARC-145细胞后60小时测定的荧光素酶活性值水平变化图。
[0019] 图10是P10代的vA-Rluc、vA-Fluc以相同M0I感染MARC-145细胞后，分别于24h、 48h、60h、72h、96h、120h收取细胞裂解物测定到的荧光素酶活性值变化图。
【具体实施方式】
[0020] 在本发明中，所述嵌合重组质粒指的是，利用反向遗传操作技术，将海肾荧光素酶 编码基因或者萤火虫荧光素酶编码基因插入HUN4-F112基因组骨架中所获得的pA-Rluc和 pA-Fluc〇
[0021] 在本发明中，所述嵌合重组病毒指的是，利用基因嵌合技术获得的全长重组质粒 pA-Rluc和pA-Fluc转染MARC-145细胞后拯救出的活病毒vA-Rluc和vA-Fluc。
[0022] 在本发明中，所述的反向遗传操作指的是：相对于经典遗传学而言的，是在获得 的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒细胞致弱毒株HuN4-F112的感染性克隆骨架上，通过 SOEPCR的方法或者定点突变的方法对病毒基因进行必要的加工和修饰，进行外源基因的插 入，再按组成顺序构建全长病毒基因组，让其装配出具有生物活性的病毒粒子，研宄突变病 毒与亲本病毒在病毒生物学特性上的变化，以及外源基因插入可能对病毒的表型、性状有 何种影响等方面的内容。
[0023] 在本发明中，所述高致病性蓝耳病细胞致弱毒株HuN4-F112的Gcnbank登录号是 EF635006。
[0024] 在本发明中，所述细胞致弱毒株HuN4-F112指的是，参考文献Shanrui Zhang， Yanjun Zhou，Yifeng Jiang，Guoxin Li，Liping Yan，Hai Yu? Guangzhi Tong. Generation of an infectious clone of HuN4_F112， an attenuated live vaccine strain of porcine reproductive and respiratory syndrome virus 的方法所构建的感染性克隆。
[0025] 以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本 发明而非用于限定本发明的范围。
[0026] 下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实 验室手册》(New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件进行。
[0027] 在本发明的实施例中，使用的病毒和细胞：MARC_145细胞（非洲绿猴肾细胞系）
[0028] 在本发明的实施例中，使用的质粒与菌株：pBlueSCript II SK(+)载体购自 Invitrogen公司，pBS-T载体、T0P10感受态细胞购自TIANGENE公司。
[0029] 在本发明的实施例中，使用的其他试剂：QIAamp Viral RNA Mini Kit购自 QIAGENE 公司，pfu II DNA Polymerase 购自 Strategene 公司，T7mMESSAGE High Yield Capped RNA Transcription Kit 购自 Ambion 公司，胶回收试剂盒和 Quant Reverse Transcriptase购自TIANGENE公司，rTaq DNA聚合酶，dNTP和限制性内切酶购自TaKaRa 公司，质粒提取试剂盒购自北京博大泰克生物基因技术有限责任公司，DMRIE-C转染试剂购 自 Invitrogen 公司，Opti-MEM 购自 Invitrogen 公司。
[0030] 在本发明的实施例中，MARC-145单层细胞采用以下方法制备：
[0031] MARC-145细胞在含有10% FBS的DMEM培养基的六孔板中贴壁长满单层后，弃培 养基，PBS洗两遍后加入0. 01M0I的病毒500微升吸附1小时后，弃吸附液，PBS洗两遍后加 入维持液（2% FBS的DMEM)培养基，37°C 5% C02培养箱中培养。
[0032] 实施例1表达海肾荧光素酶或萤火虫荧光素酶的PRRSV嵌合重组质粒的构建
[0033] 根据GenBank登录号为EF635006的碱基序列，以及pGMR-TK中Renilla Luciferase和pGL3_Basic中的Firefly Luciferase的碱基序列，设计出6条引物，用来进 行SOEPCR扩增，过程如图2所示，然后分别通过细胞转染实验，验证了获得的嵌合重组质 粒的感染性，具体过程如下：
[0034] 1.1引物设计
[0035]根据 GenBank 登录号为 EF635006 的 HuN4-Fl 12 的碱基序列、pGMR-TK 中 Renilla Luciferase 和 pGL3_Basic 中的 Firefly Luciferase 的喊基序列，设计 SOE PCR 引物，分 别命名为：册11559、冊13090、1?111。-卩2、1?111。-1?1、1?111。-卩4、1?111。-1?2/1?3，卩111。-卩2、卩111。-1?1、 Fluc-F4、Fluc-R2/R3其序列分别如下所示：
[0036] HF11559 :5' -TCATACATCCGAGTTCCTGTT-3' (SEQ ID NO. 1)
[0037] HR13090 :5，-GAAATATTGTCATGGCGAGGC-3，（SEQ ID NO. 2)
[0038] Rluc-F2 :5，-TCATTGAACCAACTTTAGGCCTGAATTGAAatgacttcgaaagtttatgatccag-3 r (SEQ ID NO. 3)
[0039] Rluc-Rl :5 ' -tttgttctggatcataaactttcgaagtcaTTTCAATTCAGGCCTAAAG-3 ' (S EQ ID NO. 4)
[0040] Rluc_F4 :5' -caaatcgttcgttgagcgagttctcaaaaatgaacaataaGTTCCGTGGCAACCCCT TTAACCAGATG-3 r (SEQ ID NO. 5)
[0041] Rluc-R2/R3：5r -CATTGTTCCGCTGAAACTCTGGTTAAAGGGGTTGCCACGGAACttattgttcat ttttgagaact-3 r (SEQ ID NO. 6)
[0042] Fluc-F2 ：5'-TCATTGAACCAACTTTAGGCCTGAATTGAAatggaagacgccaaaaacataaag-3 r (SEQ ID NO. 7)
[0043] Fluc-Rl:5' -ggcctttctttatgtttttggcgtcttccatTTCAATTCAGGCCTAAAGTT-3' （S EQ ID NO. 8)
[0044] Fluc_F4 :5' -ctcataaaggccaagaagggcggaaagatcgccgtgtaaGTTCCGTGGCAACCCCTT TAACCAGATG-3 r (SEQ ID NO. 9)
[0045] Fluc-R2/R3 :5，-CATTGTTCCGCTGAAACTCTGGTTAAAGGGGTTGCCACGGAACttacacggcga tctttccgcc-3 r (SEQ ID NO. 10)
[0046] 具体构建步骤如下：
[0047] 1. 1. 1扩增SOE-1PCR产物
[0048] 以pHuN4-F112作为模板，引物HF11559和Rluc-Rl/Fluc-Rl分别作为上游引物和 下游引物，PCR扩增突变片段S0E-1，具体如下：
[0049] PCR反应体系为：pHuN4-F112质粒模板lyL，上下游引物对（10yM)各lyL， lOXpfu Buffer5uL，2.5mM dNTP 4yL，pfu II Turbo DNA聚合酶5units，加水至50yL。
[0050] PCR反应参