一株对除草剂阿特拉津具有良好降解效果的希瓦氏菌的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一株对除草剂阿特拉津具有良好降解效果的希瓦氏菌，属于生物防治
技术领域。
【背景技术】
[0002] 阿特拉津（2-氯-4-乙胺基-6-异丙胺基-1，3,5-三嗪，Atrazine)是一种农田 中广泛使用的三嗪类除草剂，主要用于玉米、高粱、甘蔗田阔叶杂草和禾草的防除（Johnson TA，EllsworthTR，HudsonRJM，etal. 2013.)。阿特拉津在全球范围内的使用已经超过50 多年，截止到目前阿特拉津仍是应用最广泛的农业除草剂之一（AckermanF. 2007.)。由于 其半衰期长、迀移率高，已造成多个国家的土壤、地表水和地下水污染（李红梅，张新建， 李纪顺，等.2014.)，从而对生态环境和人类饮用水源造成威胁（陈建军，何月秋，祖艳 群，等.2010.;FreitasLG，SingerH，MUllerSR，etal.2008.)。研宄表明，长期接触 低剂量的阿特拉津具有干扰人体内分泌激素的活性，目前已被作为环境科尔蒙可疑物质 受到各国政府的监控（SafeS. 2005.;BianchiCL，PirolaC，RagainiV，etal. 2006.) 〇 针对于阿特拉津污染问题，生物降解的方法具有成本低、效率高、不产生二次污染等物理 法和化学法无法比拟的优势（H，Asakura，MatsutoT. 2009.;董春香，姜桂兰.2001.; CheynsK，Martin_LaurentF，BruD，etal. 2012.)。阿特拉津的生物降解途径包括三个 过程：水解、脱烷基。开环，目前研宄最深入的两株阿特拉津降解菌分别为Pseudomonas sp.ADP(SouzaMLD，SadowskyMJ，WackettLP，etal. 1999.)和Arthrobacter aurescensTCI(KS，NS，LPW，etal. 2004.)。本研宄从黑龙江省伊春市南岔区长期施用 阿特拉津的玉米田土壤中分离驯化出对除草剂阿特拉津高效降解的希瓦氏菌，对希瓦氏菌 对阿特拉津降解效果进行测定，以期对以后阿特拉津的生物治理工作提供理论基础。
[0003] 目前，已有多种阿特拉津降解菌株被国内外研宄人员从不同土壤中筛选出，如： Pseudomonassp.ADP(BehkiRM,KhanSU. 1986.) >Arthrobactersp.AD26(QL,YL,X Z，etal. 2008.)、Bacillussp.HB-6(JinhuaWang,LushengZhu，QiWang,etal. 2014.)、 Pseudaminobactersp.(ET，HZ，SMN，etal. 2000.)、Rhodococcussp.(BehkiR. 1993.)、 Klebsiellsp.Al和Comamonassp.A2(CY.2010.)等，且其中大多数菌株能够利用阿特拉 津为唯一氮源生长。但是，这些降解菌都受到氮抑制（王志刚，张颖，郭火生等.2014.) 作用，在含有其他氮源的情况下，对阿特拉津的降解效果影响巨大。
[0004] 如何寻找到一株在含有其他氮源的情况下对阿特拉津具有明显降解效果的阿特 拉津降解菌成为急需解决的一大难题？所以，发明一株对除草剂阿特拉津具有良好降解效 果的希瓦氏菌，寻找到一种对除草剂阿特拉津高效降解的希瓦氏菌是必要的。
【发明内容】
[0005] 为了克服目前发现的降解菌利用阿特拉津为唯一氮源生长则降解菌都受到氮抑 制作用，在含有其他氮源的情况下，特别是对阿特拉津的降解效果影响巨大的难题，本发 明提供了一个一株对除草剂阿特拉津具有良好降解效果的希瓦氏菌（保藏编号：CGMCC No.10859)〇
[0006] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
[0007] -株对除草剂阿特拉津具有良好降解效果的希瓦氏菌（保藏编号：CGMCC No. 10859)，具体构建及验证过程如下：
[0008] 本实验所用的土样采集自黑龙江省伊春市南岔区长期施用阿特拉津的玉米田表 层土（0-15厘米）。将土壤样品过20目筛以去除石块和植物碎肩，然后装入封口袋中4°C 保存。
[0009] 试剂：阿特拉津原药（2-氯-4-二乙胺基-6-异丙胺基-1，3, 5-三嗪）（纯度 彡98%)和氰尿酸（2,4,6_三羟基_1，3,5_三嗪）购自国药集团化学试剂有限公司（纯度 多98% )。其他常规试剂均为分析纯或更高纯度，用于液相色谱的试剂均为色谱级。
[0010] 培养基：LB培养基：胰蛋白胨10g，氯化钠10g，酵母粉5g，用蒸馏水定容到1L，pH 7.0。无机盐培养基（MSM) :KH2P040.9g，Na2HP04*12H20 6.5g，MgS04.7H20 0.2g，NaCl0.4g， 葡萄糖3g作为唯一碳源，微量元素溶液lml(微量元素溶液（g/L) :Na2B407 ? 10H20 0. 4， Na2Mo04 ? 2H20 0? 5,CuS04 ? 5H20 0? 8,FeS04 ? 7H20 2g，MnS04 ?H20 2g，ZnS04 ? 7H20 10g，EDTA 5g)，按照实验需要加入适量的阿特拉津或氰尿酸。配置固体培养基时加入2%的琼脂粉。 灭菌条件：120°C高压灭菌20分钟。
[0011] 降解菌的富集、驯化与分离：称取5g土样加入到100mL以阿特拉津为唯一氮 源的MSM液体培养基中，阿特拉津初始浓度为50mg/L，置于摇床中，30°C，150r/min振荡 培养7天。7天之后将培养液以10%接种到新的以阿特拉津为唯一氮源的MSM液体培 养基中，同时将阿特拉津浓度提升至100mg/mL，以此类推不断升高阿特拉津浓度。8次 富集培养之后，将菌液分半稀释1〇_3、1〇_ 4、1〇_5，划线培养于含有阿特拉津的1511固体培 养基中，5天之后挑取颜色、形态不相同的菌落进行纯化。经过2个多月的驯化，观察到 500mg/L阿特拉津的锥形瓶中白色沉淀大部分已经消失，且培养液趋于澄清。将阿特拉 津浓度为500mg/L的培养液采用稀释平板涂布法将培养液涂布在阿特拉津MSM固体平 板上，挑取颜色、形态各不相同的菌落进行纯化，并结合常规镜检方法进行分析，最终得 到YJY4菌株。降解菌株的鉴定：⑴生理生化鉴定：将待测菌株接种于LB固体平板上， 参照《微生物学实验》（赵斌，何绍江? 2002.)和《Bergey'sManualofSystematic Bacteriology(secondedition)》（GeorgeMG,JuliaAB,TimothyGL. 2004.)进行鉴定。 (2)16SrDNA鉴定：由于同一种、属间细菌的16SrDNA序列直接具有高度的保守性，所以 16SrDNA序列的同源性分析通常被用作细菌之间的系统分类。以各个菌株的总DNA为模 板，采用PCR技术对降解群落中的纯培养菌株进行16SrDNA序列扩增，扩增引物采取通用 引物：27-F(5' -AGAGITTGATCCTGGCTCAG-3,)和 1492-R(5' -TACCTTGTTACGACTT-3'） (刘春光，杨峰山，卢星忠等? 2010.)。PCR反应条件为：94°C5min;94°Clmin，52°Clmin， 72°C2min，30个循环；72°C10min，反应体系为25yL。扩增的产物通过试剂盒（美国Axygen 公司）回收，之后与PMD19-T载体（日本TaKaRa公司）连接，转化进大肠杆菌DH5a中，送 到苏州金唯智公司进行测序，得到的结果通过Genbank进行同源性比对，从而确定到其分 类地位。通过16SrDNA分析，YJY4被鉴定为Shewanellasp. 〇
[0012] 菌株YJY4降解效果测定：⑴阿特拉津的测定：将培养液与三氯甲烷1:2比例混 合，在摇床中充分震荡lOmin，随后离心（8000rpm)6min，用移液器吸取下层液体放入圆底 烧瓶中，用旋转蒸发仪将液体蒸干，之后用色谱级甲醇溶解残留物，过0. 22ym有机相微孔 滤膜，装入进样瓶中。检测条件（王静，李迎芳，裴丽娟等.2013.):流动相甲醇：水= 60:40 (V:V);柱温30°C;流速0. 8mL/min;检测波长225nm;进样量10yL。⑵氰尿酸的测定： 将培养液离心，吸取上清液，过0.22ym无机相微孔滤膜，装入进样瓶中。检测条件（Zhang Y,JiangZ,CaoB,etal. 2011.):流动相 0? 005mol/L磷酸氢二钾和 0? 002mol/L磷酸二氢 钾混合液：甲醇=95:5(V:V);柱温35°C;流速lmL/min;检测波长200nm;进样量20yL。
[0013] 本发明的有益效果为：本发明一株对除草剂阿特