一株刺糖多孢菌鼠李糖生物合成基因加倍工程菌株的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一株刺糖多孢菌鼠李糖生物合成基因加倍工程菌株，采用基因工程技 术，使刺糖多孢菌中的鼠李糖生物合成基因的拷贝数增加，获得杀菌素高产菌株s.SP-RM。
【背景技术】
[0002] 多杀菌素及其衍生物同时具有高效的杀虫活性及绿色安全的优良特性，成为近几 年生物杀虫制剂研宄领域的一大热点，而野生菌株极低的发酵产量是阻碍多杀菌素进一步 研宄的难题。多杀菌素通过与烟碱乙酰胆碱受体结合使昆虫神经细胞去极化，引起中央 神经系统超活化，从而导致非功能性肌收缩、衰竭和麻痹，因此它对昆虫有快速触杀和摄 食毒性。多杀菌素杀虫谱十分广泛，包括鳞翅目（Lepidoptera)、缨翅目（Thysanoptera)、 鞘翅目（Coleoptera)、膜翅目（Hymenoptera)、双翅目（Diptera)等害虫，尤其对鳞翅目、 缨翅目害虫有极强的选择性杀虫活性。多杀菌素具有诸多衍生物，到目前为止，由刺糖多 孢菌所产生的多杀菌素共分离得到30多种，其中包括9种缺少福乐糖基的拟糖苷配基 (Pseudoaglycone，PSA)，多杀菌素拟糖苷配基也可用作进一步化学修饰的底物，并产生新 的带有独特性质和活性谱的半合成多杀菌素。
[0003]目前国际上关于多杀菌素合成机制的研宄仍处在起步阶段，野生型刺糖多孢菌菌 株中多杀菌素产量极低，因此如何提高其发酵产量是亟待解决的一大难题。多杀菌素的合 成量极低，采用各种途径如培养基优化、理化诱变和分子遗传改造等方法对其进行菌种改 良是非常有必要的。利用基因工程技术对刺糖多孢菌基因组进行定向遗传修饰，有望成为 提尚多杀菌素广量有效方法。
[0004]NDP-鼠李糖同时参与刺糖多孢菌的初级代谢与次级代谢过程，既是刺糖多孢菌菌 株细胞壁结构组分，也是其次级代谢物多杀菌素的重要活性成分。NDP-鼠李糖的合成首先 通过NDP-葡萄糖合成酶（以编码）将葡萄糖-1-磷酸催化成核苷二磷酸葡萄糖，然后由 葡萄糖脱氢酶（识*编码）将NDP-D-葡萄糖催化生成NDP-4-酮-6-脱氧-D-葡萄糖，再由 3'，5' -表异构酶（印/编码）和酮还原酶（編码）将NDP-4-酮-6-脱氧-D-葡萄糖转 化成NDP-鼠李糖。然而，四个鼠李糖生物合成基因在5： 菌株基因组上都只有一个 拷贝数，且不存在于多杀菌素基因簇中，而是分散在染色体的不同位置。
[0005] 但现有将基因整合至刺糖多孢菌基因组中的技术均比较困难，如原生质体转化技 术和接合转移技术成功概率均比较低。
【发明内容】
[0006] 本发明要解决的技术问题是，克服现有技术的不足，提供一株刺糖多孢菌鼠李糖 生物合成基因加倍工程菌株，利用基因工程技术，通过定向遗传修饰刺糖多孢菌，获得多杀 菌素高产菌株。
[0007] 本发明解决其技术问题采用的技术方案是，一株刺糖多孢菌鼠李糖生物合成基因 加倍工程菌株，即刺糖多抱菌S.sp_RM，SaccharopolysporaspinosaS.sp-RM，于 2015 年6月8日在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：中国武汉武汉大学）保藏，菌种 保藏号为CCTCCNO:M2015363。
[0008] 所述的刺糖多孢菌鼠李糖生物合成基因加倍工程菌株，刺糖多孢菌染色体上整合 有含3'-0-甲基鼠李糖生物合成基因的质粒pJNRM。
[0009] 本发明之鼠李糖合成基因加倍工程菌株的获得步骤如下： (1) 接合转移构建工程菌株S.sp-RM及其PCR鉴定； (2) HPLC分析工程菌多杀菌素的生物合成能力； (3) 荧光定量RT-PCR分析鼠李糖基因的转录水平； (4) 比较蛋白质组学分析鼠李糖合成基因加倍对刺糖多孢菌蛋白表达水平的影响。
[0010] 本发明通过增加多杀菌素限速酶基因一一NDP-鼠李糖基因的拷贝数，获得一株 鼠李糖合成基因加倍工程菌株。采用属间接合转移方法将含负责NDP-鼠李糖生物合成的 郝识*四个基因的功能载体pJNRM导入刺糖多孢菌中，获得了NDP-鼠李糖合 成基因加倍的工程菌株S.sp-RM。PCR鉴定结果表明，该质粒已成功地整合至刺糖多孢菌 基因组上；实时荧光定量PCR结果显示，工程菌中识/Hre、6>/7i和以(基因的转录水平分 别比原始菌株提高了 80. 3倍、30. 8倍、23. 8倍和18. 3倍；HPLC检测结果表明，工程菌S. sp-RM中多杀菌素产量比原始菌株提高73%。利用SDS-PAGE方法和1D-LC-MS/MS对工程 菌株S.sp-RM和原始菌株5：spiflosa的全蛋白进行比较分析发现鼠李糖生物合成基因的 加倍不仅如预期猜测能影响鼠李糖和福乐糖胺的生物合成，而且能通过影响核糖体蛋白装 载过程、PKS合成来调控刺糖多孢菌次级代谢过程。
[0011] 微生物保藏情况说明 本发明之刺糖多孢菌鼠李糖生物合成基因加倍工程菌株，即刺糖多孢菌S.SP-RM，SaccharopolysporaspinosaS.sp-RM，于2015年6月8日在中国典型培养物保藏中心（简 称CCTCC，地址：中国武汉武汉大学）保藏，菌种保藏号为CCTCCNO:M2015363。
【附图说明】
[0012] 图1为接合子的PCR鉴定图；M，DNAMarker;泳道1，阴性对照；泳道2,阳性对照； 泳道3-5，接合子S.sp-RM基因组为模板； 图2 -A和图2 -B为载体pJNRM整合位点的鉴定图；A，载体可能的整合方式示意图；B，PCR鉴定载体整合方式； 图3 -A为工程菌株S.sp-RM(A)的HPLC分析图； 图3 -B为原始菌株51沙/加似（B)的HPLC分析图； 图4为rAa基因的实时荧光定量RT-PCR分析； 图5为SDS-PAGE分析原始菌与工程菌（72h)全蛋白图； 图6为差异蛋白调控网络分析图。
【具体实施方式】
[0013] 以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。
[0014] 实施例1 本实施例之刺糖多孢菌鼠李糖生物合成基因加倍工程菌株，即刺糖多孢菌S.SP-RM， SaccharopolysporaspinosaS.sp-RM，于2015年6月8日在中国典型培养物保藏中心（简 称CCTCC，地址：中国武汉武汉大学）保藏，菌种保藏号为CCTCCNO:M2015363。
[0015](一）具体培养基配方和培养条件 (1) 5：沙/加似种子活化采用SP-2培养基：葡萄糖9g/L，TrypticSoyBroth30g/ L，酵母提取物3g/L，硫酸镁2g/L。接种单克隆或1%菌种保藏液加入装有20mLSP-2的 250mL摇瓶中，30°C，300r/min培养 48-72h; (2) 转接采用TSB培养基：TrypticSoyBroth30g/L。接种1%菌液加入装有20mL SP-2 的 250mL摇瓶中，30 °C，300r/min培养 48-72h; (3) 发酵培养采用SP-3培养基：葡萄糖60g/L，可溶性淀粉10g/L，玉米浆7g/L，棉 籽粉22.5g/L，豆饼粉5g/L，酵母提取物2g/L，碳酸钙5g/L，油酸甲酯42mL/L，微量元 素2. 5mL/L(氯化钴0. 3g/L，硫酸锌1. 4g/L，硫酸亚铁3. 8g/L，硫酸镍0. 5g/L，溶于 0. 5mol/L的盐酸中），pH7. 0。接种10%菌种保藏液加入装有20mLSP-3的300mL摇瓶 中，30°C，300r/min培养 10-12d; (4) 接合转移米用R6固体培养基：培养基（g/L):Sucrose200,Dextrin10,Casamino acids1，MgS04 ? 7H20 0? 05,K2S04 0? 1，FeS04 ? 7H20 0? 1，MnCl2 ? 4H20 0? 001，ZnS04 ? 7H20 0? 001，BHI13,Agar12,加入678mL蒸馏水，定容至1L，115 °C灭菌30min。待培养基 冷却至50 °C加入以下三种经0.22ym(微米)滤膜过滤除菌的物质，1mol/LL-glutamic &(^(165 1111，1111〇1/1〇&(：12.21120 48 1111及1111〇1/1丙磺酸（]\?^5)5 111匕固体平板转接 采用BHI固体培养基。
[0016](二）属间接合转移 首先将已构建好的质粒pJNRM电转至凡coJ7S17,经Trime、Str和Apr三抗筛选阳性 转化子，提取质粒酶切鉴定获得转化子凡