与多糖聚合物粘合剂缀合的鼠李糖乳杆菌RHT‑3201，及其用于预防或治疗特应性疾病的用途的制作方法

本申请要求并享有2014年05月07日在韩国知识产权局提交的韩国专利申请第10-2014-0054237号的优先权，其全文以引用的方式纳入本说明书。本发明涉及一种与多糖聚合物粘合剂缀合的热灭活鼠李糖乳杆菌，及其制备方法和用途。更具体而言，涉及一种与多糖聚合物粘合剂缀合的热灭活鼠李糖乳杆菌的制备方法，通过所述方法制备的与多糖聚合物粘合剂缀合的热灭活鼠李糖乳杆菌，以及包含所述与多糖聚合物粘合剂缀合的热灭活鼠李糖乳杆菌作为有效成分的预防和治疗特应性皮炎的药物组合物以及食品组合物。
背景技术：
：特应性皮炎(Atopicdermatitis，AD)是指表现为瘙痒症状的慢性、复发性炎症皮肤病，主要多见于婴幼儿和儿童。已知特应性皮炎和过敏性鼻炎、支气管哮喘共同作为最有代表性的过敏症状，儿童的患病率为10～30％，成人的患病率为1～3％。特应性皮炎是免疫系统对侵入到体内的尘螨等抗原做出过敏反应的症状。抗原通过巨噬细胞递送至T细胞，T细胞根据抗原种类或对做出反应的受体的种类，分化为Th1细胞或Th2细胞。Th2细胞通过细胞因子如IL-4、IL-5和IL-10激活体液免疫，并激活B细胞使IgE(免疫球蛋白)生成量增多从而引发特应性皮炎。相反，Th1细胞通过IL-12、IFN-γ激活细胞免疫，IFN-γ起到抑制IgE生成的作用。因此，可维持Th1细胞和Th2细胞的均衡的免疫调节而缓解特应性症状。目前虽然没有明确的针对特应性皮炎的治疗方法，但是使用着抗过敏剂、抗组胺剂、类固醇类等药物。其中，多以软膏剂形式用于治疗特应性皮炎的类固醇类药物通过弱化免疫应答而减轻炎症，然而，已报道长时间使用时会引起多种副作用。另外，许多乳酸菌或含有乳酸菌的乳制品作为具有免疫调节作用的食品而上市销售。作为乳酸菌可列举乳杆菌属、乳酸乳球菌属、链球菌属、片球菌属、肠球菌属等，并已知这些乳酸菌具有增强免疫或抗过敏作用。对此，本发明人的长时间使用时无副作用并可从根本上治疗特应性皮炎的新菌株材料——具有Th1细胞和Th2细胞的均衡免疫调节功能的鼠李糖乳杆菌IDCC3201曾获得专利授权[专利文献1007429000000]。然而，人体肠道中栖息有约500多种100兆个以上的肠道细菌，有害菌如大肠菌以及有益菌如乳酸菌作为常住菌群维持着均衡，因此在给予乳酸菌益生菌时，在肠道粘膜上进行附着竞争具有局限性，因此其效果也根据附着率而不同。此外，一定数量的乳酸菌益生菌在通过胃肠道时死亡或在进行附着竞争时被淘汰，然后随排便排出。因此，乳酸菌益生菌在它们治疗重度特应性疾病方面具有局限性。此外，为了提高益生菌的肠道粘膜附着率，需要以超过标准菌数的过量给药方式进行摄取。由于益生菌在到达肠道之前需要穿过人体内的层层障碍，因此无法预测所摄取的菌数和特应性疾病的治疗效率。由于这些问题，目前几乎没有显示出与类固醇类药物相同水平的效果的乳酸菌剂。虽然试图作为复合剂而提高其效果，但在益生菌菌株的贮存中，由于自然地出现经时死亡，因此无法对其效果定制正式标准。最近，随着对人体肠道粘膜免疫体系进行相关研究，已报道了作为宿主的人体的肠道免疫细胞和乳酸菌细胞壁成分之间的相互作用和附着性能。其中，树突细胞(DC)的Toll样受体-2(TLR-2)与存在于乳酸菌细胞壁上的脂磷壁酸和肽聚糖结合而传递免疫相关的信号。此外，当发挥免疫调节作用的乳酸菌在特种培养基中进行发酵时，会在细菌外生成短链脂肪酸(SCFA)和免疫蛋白，从而促进从Th1细胞中分泌IFN-γ和IL-12，因此，起到改善特应性皮炎的作用。但是，大多数乳酸菌发酵产物不起改善特应性皮炎的作用，只有一部分选择性的乳酸菌生产这样的物质，因此开发这种乳酸菌的价值很高。在这样的背景下，需要开发一种能从根本上有效治疗特应性皮炎的组合物，其能克服用于特应性皮炎的类固醇类药物的副作用以及根据乳酸菌益生菌的附着率而治疗特应性皮炎的局限性。技术实现要素：发明要解决的问题对此，本发明人在开发可维持与类固醇类药物相同水平的效果且无副作用的治疗特应性皮炎的药物而进行研究时，证实通过在培养滤液中混合多糖聚合物而制备的粘合剂与热灭活(heat-killed)鼠李糖乳杆菌的缀合物，不仅对肠粘膜的附着性能优异，对重度特应性皮炎具有治疗效果，而且无副作用，从而完成了本发明。因此，本发明的目的是提供一种与多糖聚合物粘合剂缀合的鼠李糖乳杆菌的制备方法，其包含：(a)将通过培养鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)而制备的发酵培养液分离成细菌和发酵滤液的步骤；(b)将步骤(a)中的发酵滤液和多糖聚合物混合而制备多糖聚合物粘合剂的步骤；(c)将步骤(a)中的细菌热灭活的步骤；以及(d)将步骤(c)中的热灭活细菌与步骤(b)中制备的粘合剂缀合的步骤。本发明的另一个目的是提供一种通过所述方法制备的与多糖聚合物粘合制缀合的鼠李糖乳杆菌。本发明的再一个目的是提供一种预防和治疗特应性皮炎的药物组合物，该组合物包含与多糖聚合物粘合制缀合的鼠李糖乳杆菌作为有效成分。本发明的再一个目的是提供与多糖聚合物粘合剂缀合的鼠李糖乳杆菌用于制备治疗特应性皮炎的药剂的用途。本发明的再一个目的是提供一种预防或治疗特应性疾病的方法，其特征在于对需要预防或治疗特应性疾病的个体给予有效剂量的与多糖聚合物粘合剂缀合的鼠李糖乳杆菌。本发明的再一个目的是提供一种用于预防和改善特应性皮炎的食品组合物，该组合物包含与多糖聚合物粘合剂缀合的鼠李糖乳杆菌作为有效成分。本发明的再一个目的是提供与多糖聚合物粘合剂缀合的鼠李糖乳杆菌用于制造预防和改善特应性皮炎的食品的用途。本发明的再一个目的是提供一种预防或改善特应性疾病的方法，其特征在于使需要预防或改善特应性疾病的个体摄入有效剂量的与多糖聚合物粘合剂缀合的鼠李糖乳杆菌作为有效成分的食品。解决问题的方法为了实现本发明的目的，提供一种与多糖聚合物粘合制缀合的鼠李糖乳杆菌的制备方法，其包含：(a)将通过培养鼠李糖乳杆菌而制备的发酵培养液分离成细菌和发酵滤液的步骤；(b)将步骤(a)中的发酵滤液和多糖聚合物进行混合而制备多糖聚合物粘合剂的步骤；(c)将步骤(a)中的细菌热灭活的步骤；以及(d)将步骤(c)中的热灭活细菌与步骤(b)中制备的粘合剂缀合的步骤。为了实现本发明的另一个目的，提供一种通过所述方法制备的与多糖聚合物粘合剂缀合的鼠李糖乳杆菌。为了实现本发明的再一个目的，提供一种用于预防和治疗特应性皮炎的药物组合物，该组合物包含与多糖聚合物粘合剂缀合的鼠李糖乳杆菌作为有效成分。为了实现本发明的再一个目的，提供与多糖聚合物粘合剂缀合的鼠李糖乳杆菌用于制备治疗特应性皮炎的药剂的用途。为了实现本发明的再一个目的，提供一种治疗或预防特应性疾病的方法，其特征在于对需要治疗或预防特应性疾病的个体给予有效剂量的与多糖聚合物粘合剂缀合的鼠李糖乳杆菌。为了实现本发明的再一个目的，提供一种用于预防或改善特应性皮炎的食品组合物，该组合物包含与多糖聚合物粘合制缀合的鼠李糖乳杆菌作为有效成分。为了实现本发明的再一个目的，提供与多糖聚合物粘合剂缀合的鼠李糖乳杆菌用于制造改善特应性皮炎的食品的的用途。为了实现本发明的再一个目的，提供一种预防或改善特应性疾病的方法，其特征在于使需要预防或改善特应性疾病的个体摄入有效剂量的与多糖聚合物粘合剂缀合的鼠李糖乳杆菌作为有效成分的食品。下文中对本发明进行详细的说明。本发明提供一种与多糖聚合物粘合剂缀合的鼠李糖乳杆菌的制备方法，其包含：(a)将通过培养鼠李糖乳杆菌而制备的发酵培养液分离成细菌和发酵滤液的步骤；(b)将步骤(a)中的发酵滤液和多糖聚合物进行混合而制备多糖聚合物粘合剂的步骤；(c)将步骤(a)中的细菌热灭活的步骤；以及(d)将步骤(c)中的热灭活细菌与步骤(b)中制备的粘合剂缀合的步骤。步骤(a)是将培养鼠李糖乳杆菌所得的发酵培养液分离成细菌和发酵滤液的过程。本发明的所述鼠李糖乳杆菌乳酸菌株包含所有鼠李糖乳杆菌菌株(strain)，优选为鼠李糖乳杆菌KCTC10833BP(LactobacillusrhamnosusKCTC10833BP)。所述鼠李糖乳杆菌KCTC10833BP在本申请人之前的韩国专利申请(10-2006-0038066)中曾以“鼠李糖乳杆菌IDCC3201”命名，在本说明书中将混用所述名称。本发明中的所述术语“培养”包含发酵的概念。本发明的培养可根据公知的乳酸菌培养方法进行，例如可使用将细菌接种到培养基或培养基质，并在需氧或厌氧环境中保持预定的生长温度，并放置一段时间的方法，但不限于此。本发明中的“培养基”是指含有用于培养动物细胞、植物细胞或微生物的必要养分的固体或液体培养基质。本发明的培养基可以是公知的乳酸菌培养基，例如可以是MRS(deManRogosaSharpe)液体基质、APT(含有吐温的通用的(AllPurposewithTween))基质或BHI(脑心灌注(BrainHeartInfusion))基质，可优选MRS(deManRogosaSharpe)液体基质，但不限于此。所述基质可根据本领域技术人员的需要对构成基质的物质组分以及含量进行选择性调整而以改良的基质(例如，改良的MRS基质)形式使用。本发明的所述培养基包含乳酸菌生长中必须的碳源和氮源、无机盐类以及生长素等作为培养基质。所述碳源、氮源、无机盐类以及生长素只要是在乳酸菌生长中起到相乘作用的物质就不限制其种类，这在该领域是公知的。例如，作为碳源可使用多种碳水化合物，其中优选葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖、乳糖、木糖、半乳糖或阿拉伯糖。并且，作为氮源，可使用多种有机氮源，其中优选酵母提取物、大豆蛋白(soytone)、蛋白胨、牛肉提取物、胰蛋白胨、酪胨。作为无机盐类只要是本领域公知的乳酸菌生长用无机盐类就不限制其种类，例如可以是硫酸镁(MgSO4)、硫酸锰(MnSO4)、磷酸氢二钾(K2HPO4)、氯化铵(NH4Cl)、碳酸钙(CaCO3)、乙酸钠(CH3COONa)。此外，根据需要可在培养基质中任选追加多种食品原料粉末或提取物，例如可使用玉米粉末或提取物、乳清粉末或提取物、脱脂奶粉或提取物、绿茶粉末或提取物、蘑菇粉末或提取物等，但不限于此。在培养过程中，温度可根据乳酸菌种类而改变，例如可以是30至45℃、优选是33至40℃、最优选是35至39℃，但不限于此。在培养过程中，时间可根据期望的工作效率而改变，可以是12至96小时，但不限于此。本文所用的术语“发酵培养液”是指将菌株接种到液体基质并进行发酵(或培养)而获得的培养液，术语“发酵滤液”是指从所述发酵培养液中去除细菌而获得的培养滤液。细菌和发酵滤液的分离可根据公知的细菌分离方法进行，例如可使用离心分离或超滤法，但不限于此。步骤(b)是将步骤(a)中的发酵滤液和多糖聚合物进行混合而制备多糖聚合物粘合剂的过程。本文所用的术语“多糖聚合物粘合剂”是指发酵滤液和多糖聚合物的混合物或其浓缩物，可根据粘合剂的组成和制备工艺调节对肠道粘膜的附着性能以及免疫细胞中细胞因子的生成潜能。步骤(b)中的多糖聚合物只要是本领域公知的多糖聚合物就不限制其种类，例如可包含透明质酸、藻酸盐、麦芽糊精、壳聚糖、卡拉胶、半乳甘露聚糖、葡甘露聚糖、右旋糖酐、褐藻糖胶(fucoidan)、琼脂、卟啉(porphyran)、几丁质(chitin)等。本发明所述的多糖聚合物优选透明质酸、藻酸盐、麦芽糊精、壳聚糖。多糖聚合物的添加比率可根据目标粘度或附着力而进行选择性改变，例如可在发酵滤液中添加0.0001％(w/v)至10％(w/v)的比率，但不限于此。在本文中，步骤(b)的优选实施方案是将作为多糖聚合物的透明质酸以0.0001％(w/v)至10％(w/v)的比率添加至发酵滤液并混合，最优选是将透明质酸以0.0001％(w/v)至0.01％(w/v)的比率添加至发酵滤液。透明质酸是由氨基酸和糖醛酸组成的复合多糖之一，是由N-乙酰氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸组成的高分子化合物。本发明所述的透明质酸，例如可包含具有100万、200万、300万、400万、450万分子量的透明质酸等，其中优选100万、200万分子量的透明质酸，更优选100万分子量的透明质酸，但其分子量不限于此。在步骤(b)中，为了获得高浓度多糖聚合物可追加包含浓缩过程。浓缩可根据本领域公知的浓缩装置或浓缩方法进行，可以使用例如沉淀浓缩、蒸发浓缩、减压浓缩、超滤法、反渗透法、离心分离法，其中优选减压浓缩，但不限于此。步骤(c)是将步骤(a)中的细菌热灭活的过程。术语“热灭活”是指通过预定时间的加热杀死益生菌，热灭活条件会影响到细菌内所包含的有效成分的组成、细菌结构、肠道附着能力。将益生菌热灭活的最重要目的在于，通过诱导鼠李糖乳杆菌细胞结构物质中所包含的作为代表成分的脂膜酸和肽聚糖等而形成有利于附着肠道粘膜免疫细胞的结构。即构成所述细胞结构的脂膜酸和肽聚糖等与肠道粘膜树状突细胞的TLR-2结合从而促进生成免疫相关的细胞因子的机制，因此以具有最有利的附着率的形式而制备的结构尤为重要。本发明的热灭活温度没有限制，只要在不使细菌内包含的功能性成分变质的温度范围内即可，例如可以是60℃至100℃的温度范围，优选70℃至90℃，更优选75℃至85℃。热灭活时间没有限制，只要在不使细菌内包含的功能性成分变质的时间范围内即可，例如可以是10分钟至120分钟，优选30分钟至90分钟，最优选50分钟至70分钟。在热灭活过程之后，可根据本领域技术人员的需要任选地追加冷却过程。所述冷却过程可根据公知的冷却方法进行，可根据目标改变冷却温度的选择，例如可在10℃至40℃的温度范围内进行冷却，优选在25℃至35℃的温度范围内进行冷却，但不限于此。步骤(d)是将步骤(c)中的热灭活细菌与步骤(b)中制备的粘合剂缀合的过程。术语“缀合”是指2个以上物质偶联(联结)形成一个单位体。在步骤(d)中，通过将步骤(c)中的热灭活细菌在步骤(b)中制备的粘合剂中浸透或将步骤(c)中的热灭活细菌与步骤(b)中制备的粘合剂混合而诱发的一系列的反应，而将粘合剂和热灭活的细菌缀合起来。包含步骤(a)至(d)的制备方法，在制备与多糖聚合物粘合剂缀合的鼠李糖乳杆菌时，为了方便处理、贮存等可根据需要任选地包括添加赋形剂的过程、干燥过程和粉碎过程。赋形剂的类型没有限制，只要是本领域公知的赋形剂即可。赋形剂的实例可包括淀粉。所述干燥过程，可通过公知的干燥方法进行，例如可以是冷冻干燥、喷雾干燥或热风干燥，但不限于此。本发明提供通过所述制备方法制备的与多糖聚合物粘合剂缀合的鼠李糖乳杆菌。本发明的与多糖聚合物粘合剂缀合的鼠李糖乳杆菌的特征在于：通过包含步骤(a)至(d)的制备方法而制备。所述与多糖聚合物粘合剂缀合的鼠李糖乳杆菌被本发明人命名为“RHT-3201”，并在本说明书中将混用所述术语。本发明的与多糖聚合物粘合剂缀合的鼠李糖乳杆菌具有优异的治疗特应性疾病的效果，特别是显著改善了现有乳酸菌剂所具有的肠道粘膜附着竞争力(参见实施例6)，并具有和现有类固醇类药物(例如地塞米松)相同水平的预防、改善或治疗特应性皮炎的效果(参见实施例9、10)。此外，在口服乳酸菌益生菌时，对于胃肠环境的稳定性问题，本发明的与多糖聚合物粘合剂缀合的鼠李糖乳杆菌比益生菌以更高的水平维持其功能(有效性)。更具体而言，即使暴露在人工胃酸(胃酸)以及人工肠液(胆汁酸)中也可以维持高水平的对肠道粘膜的附着效率(参见实施例7)，也证实了在各温度下的贮存稳定性(参见实施例8)。本文所使用的“特应性疾病”是指具有特应性倾向的个体在皮肤、呼吸器官粘膜、眼粘膜、肠道粘膜等上出现的一系列过敏性症状，所述特应性倾向(过敏性体质)表现为家族遗传特性。由于特应性倾向而引起过敏性症状有，过敏性皮炎、过敏性鼻炎、哮喘、过敏性结膜炎、过敏性荨麻疹等，这些疾病可单独出现或多种同时出现。特应性皮炎在具有遗传性过敏症状的人的皮肤疾病中是最具有代表性的，也是通常被称为胎热的慢性皮肤疾病，主要症状是皮肤干燥症状以及瘙痒症状，具有免疫学特点并伴有其它过敏性疾病，如荨麻疹、金属过敏、哮喘或过敏性鼻炎等，并具有家族性倾向。本文所使用的“特应性皮炎(AD)”是一种具有瘙痒症状的慢性和复发性炎症皮肤病，并表现为免疫系统对侵入到体内的抗原如尘螨做出的过敏反应。侵入到体内的抗原通过巨噬细胞递送到T细胞，T细胞根据抗原种类或对其做出反应的受体的种类而分化为Th1细胞或Th2细胞。Th2细胞通过IL-4、IL-5和IL-10等细胞因子激活体液免疫，并激活B细胞使IgE数量增多从而引发特应性皮炎。即，对于特应性皮炎中的免疫异常，免疫球蛋白(IgE)附着在人体内血管周围或皮肤中的肥大细胞的表面上，当抗原再次侵入到人体时，抗原和免疫球蛋白结合并激活肥大细胞，使其分泌组胺等化学物质。这些化学物质通过刺激血管和皮肤，在皮肤上引发红色的斑点、肿胀和瘙痒并诱发特应性皮炎或使特应性皮炎恶化。相反，Th1细胞通过IL-12和IFN-γ激活细胞免疫，IFN-γ具有抑制IgE生成的作用。因此，Th1细胞和Th2细胞的均衡的免疫调节是预防或治疗特应性皮炎的关键，本发明的与多糖聚合物粘合剂缀合的鼠李糖乳杆菌的特征在于：对所述Th1细胞和Th2细胞的均衡的免疫调节具有优异的效果，特别是根据特应性皮炎的严重程度通过不同的免疫调节机制实现Th1型细胞因子和Th2型细胞因子的均衡的免疫调节(参见实施例9、10)。即，在轻度特应性皮炎中表现为调节以及维持Th1和Th2细胞的免疫学均衡，而在重度特应性皮炎中表现为通过刺激调节性T细胞(RegulatoryTcell)而抑制Th1和Th2细胞的活性，从而治疗和改善重度特应性皮炎。因此，本发明提供一种用于预防和治疗特应性皮炎的药物组合物，其包含与多糖聚合物粘合剂缀合的鼠李糖乳杆菌作为有效成分。此外，本发明提供与多糖聚合物粘合剂缀合的鼠李糖乳杆菌用于制备治疗特应性皮炎的药剂的用途；以及一种预防或改善特应性疾病的方法，其特征在于给予需要预防或改善特应性疾病的个体有效剂量的与多糖聚合物粘合剂缀合的鼠李糖乳杆菌。本发明的所述特应性皮炎根据病症的进行程度分为轻度、中度、重度等，本发明的特应性皮炎优选可为重度特应性皮炎。本文所用的术语“个体”是指动物，可优选哺乳动物，特别是包含人类的动物。目前有很多关于特应性皮炎的临床进展以及治疗效果的尺度(scale)。已知最具代表性的是湿疹面积和严重程度指数(EczemaAreaandSeverityIndex，EASI)、特应性皮炎评分(SCORingAtopicDermatitis，SCORAD)、面向患者的湿疹测量(PatientOrientedEczemaMeasure，POEM)和三项严重性(ThreeItemSeverity，TIS)等。本发明优选以特应性皮炎评分(SCORingAtopicDermatitis，SCORAD)对特应性皮炎进行症状程度分类。本发明的药物组合物可单独包含药学上有效量的与多糖聚合物粘合剂缀合的鼠李糖乳杆菌或还可包含至少一种药学上可接受的载体。本发明的药物组合物可以以单剂量给予患者，也可以通过以多剂量长期给药的分级治疗方案给药。本文所用的术语“药学上有效的量”是指相对于阴性对照组显示出更强反应的量，优选为足以治疗或预防特应性皮炎的量。本发明的与多糖聚合物粘合剂缀合的鼠李糖乳杆菌的有效量可以是0.001至1000mg/kg体重/天，优选0.055至16.65mg/kg体重/天，但不限于此。所述药学上有效的量可根据疾病及其严重程度、患者年龄、体重、健康状况、性别、给药途径以及治疗时间等多种因素而适当地进行改变。可使用本领域公知的方法根据给药途径而将本发明的组合物和药学上可接受的载体配制为多种剂型。本文所用的术语“药学上可接受的”是指生理学上可接受的，当施用于人时，不抑制活性成分的作用，通常不引起胃肠障碍、眩晕症等过敏反应或与此类似的反应的非毒性组合物。可使用本领域公知的方法根据给药途径而将本发明的组合物和药学上可接受的载体配制为多种剂型。给药途径可以是口服或肠胃外给药，优选口服，但不限于此。在口服本发明的药物组合物的情况中，本发明的药物组合物和适当的口服用载体，根据本领域公知的方法可配制为粉末、颗粒、锭剂、丸剂、糖衣锭剂、胶囊剂、液剂、凝胶剂、糖浆剂、悬浮液、片剂等形态。例如，口服制剂可通过将活性成分和固体赋形剂进行组合后粉碎，然后添加合适的辅助剂后加工成颗粒混合物从而获得片剂或糖衣片剂。合适的赋形剂的实例可含有，包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藓醇以及麦芽糖醇等的糖类和包括玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉以及土豆淀粉等的淀粉和包括纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠以及羟丙基甲基纤维素等的纤维素类和像明胶、聚乙烯吡咯烷酮等的填充剂。并且，根据情况可添加交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、藻酸或藻酸钠等作为崩解剂。本发明的药物组合物还可追加包含抗凝固剂、润滑剂、润湿剂、香料、乳化剂以及防腐剂。并且，在以肠胃外方式给药的情况，本发明的药物组合物和适当的肠胃外载体，可根据本领域公知的方法进行配制。此外作为药学上可接受的载体，可参考记载于以下文献中的资料(Remington′sPharmaceuticalSciences，19thed.，1995，MackPublishingCompany，Easton，PA)。此外，本发明的药物组合物可与已知具有预防和治疗特应性疾病活特应性皮炎效果的化合物组合给药。此外，本发明提供一种用于预防和改善特应性皮炎的食品组合物，该组合物包含与多糖聚合物粘合剂缀合的鼠李糖乳杆菌作为有效成分。此外，提供与多糖聚合物粘合剂缀合的鼠李糖乳杆菌用于制造预防和改善特应性皮炎的食品的用途；以及预防或改善特应性疾病的方法，其使需要预防或改善特应性疾病的个体摄入有效剂量的与多糖聚合物粘合剂缀合的鼠李糖乳杆菌作为有效成分的食品。本文所用的术语“个体”是指动物，可优选哺乳动物，特别是包含人类的动物。本发明的食品组合物包含所有类型的食品组合物，包括功能性食品、营养补剂、健康食品以及食品添加剂、乳酸菌饮料、发酵乳等。上述类型的食品组合物可通过本领域公知的方法制造。优选本发明的所述食品可为发酵乳、酸奶、饮料、乳饮料、食品添加剂以及健康功能食品。例如，作为健康食品，将本发明的与多糖聚合物粘合剂缀合的鼠李糖乳杆菌制造成乳酸菌饮料、发酵乳、茶、果汁以及饮料形式饮用或可进行颗粒化、胶囊化以及粉末化供摄入。并且，将本发明的与多糖聚合物粘合剂缀合的鼠李糖乳杆菌和已知对特应性疾病(特别是特应性皮炎)具有改善效果的物质以及活性成分混合而制备成组合物的形式。同样，作为功能性食品，可在饮料(包含酒精饮料)、水果以及其加工食品(例：水果灌装罐头、瓶装罐头、果酱、果子酱等)、鱼类、肉类以及其加工食品(例：火腿、香肠、咸牛肉等)、面包类以及面类(例：乌冬面、荞麦面、拉面、意大利面、通心粉等)、果汁、各种饮料、饼干、饴糖、乳制品(例：黄油、奶酪等)、使用植物油脂、人造奶油、植物性蛋白质、蒸煮食品、冷冻食品、各种调味料(例：大酱、酱油、酱汁等)等中添加与多糖聚合物粘合剂缀合的鼠李糖乳杆菌而制造。在本发明的食品组合物中，与多糖聚合物粘合剂缀合的鼠李糖乳杆菌的含量优选为最终制造的食品的0.001至50重量％，但不限于此。此外，为了将本发明的与多糖聚合物粘合剂缀合的鼠李糖乳杆菌作为食品添加剂使用可制备成粉末或浓缩液形式使用。在本发明的药物组合物和食品组合物中，所混合的有效成分的量可根据其使用目的(预防、保健或缓解症状)适当地进行选择，例如以108CFU/g至1010CFU/g的浓度包含与多糖聚合物粘合剂缀合的鼠李糖乳杆菌，但不限于此。本发明的与多糖聚合物粘合制缀合的鼠李糖乳杆菌的有效量可依据上述浓度范围而确定，但在以健康和卫生为目或以健康调节为目的长期摄取时，可在所述范围以下，并且由于有效成分在安全性方面完全没有问题，因此可使用所述范围以上的量。有益效果本发明的与多糖聚合物粘合剂缀合的热灭活鼠李糖乳杆菌具有显著的对特应性疾病的治疗效果，特别是显著改善现有乳酸菌剂所具有的肠道粘膜附着竞争力，并显示出和类固醇类药物相同水平的预防、改善或治疗过敏性皮炎的效果。此外，本发明的与多糖聚合物粘合剂缀合的热灭活鼠李糖乳杆菌具有优异的对Th1细胞和Th2细胞的均衡的免疫调节效果，特别是根据特应性皮炎的严重程度，通过不同的免疫调节机制实现Th1型细胞因子和Th2型细胞因子的均衡的免疫调节。附图说明图1为表示透明质酸结构的电子显微镜图像的图。图2为表示透明质酸浓缩粘合剂结构的电子显微镜图像的图。图3为表示热灭活前的鼠李糖乳杆菌IDCC3201结构的电子显微镜图像的图。图4为表示热灭活后的鼠李糖乳杆菌IDCC3201结构的电子显微镜图像的图。图5为表示本发明RHT-3201的结构的电子显微镜图像的图。图6为表示在重度特应性皮炎模型中，对本发明RHT-3201的治疗效果的SCORAD指数的评估分数的图。图7为表示在重度特应性皮炎模型中，对本发明RHT-3201的治疗效果的肉眼观察结果的图。图8为表示本发明RHT-3201的给药和抓挠行为变化关系的图。图9为表示本发明RHT-3201的给药和体重变化关系的图。图10为表示本发明RHT-3201的给药和血液中IgE含量变化关系的图。图11为表示在重度特应性皮炎模型中，本发明RHT-3201的给药和小鼠淋巴结变化的肉眼观察结果图。图12为表示在重度特应性皮炎模型中，本发明RHT-3201的给药和小鼠淋巴结大小变化关系的图。图13为表示在重度特应性皮炎模型中，本发明RHT-3201的给药和小鼠淋巴结重量变化关系的图。图14为表示在重度特应性皮炎模型中，本发明RHT-3201的给药和IFN-γ生成率变化关系的图。图15为表示在重度特应性皮炎模型中，本发明RHT-3201的给药和IL-12生成率变化关系的图。图16为表示在重度特应性皮炎模型中，本发明RHT-3201的给药和IL-4生成率变化关系的图。图17为表示在重度特应性皮炎模型中，本发明RHT-3201的给药和IL-10生成率变化关系的图。图18为表示在重度特应性皮炎模型中，本发明RHT-3201的给药和IL-4/IFN-γ比率关系的图。图19为表示在重度特应性皮炎模型中，本发明RHT-3201的给药和IFN-γ/IL-10比率关系的图。图20为表示在重度特应性皮炎模型中，本发明RHT-3201的给药和IL-4/IL-10比率关系的图。图21为表示在重度特应性皮炎模型中，本发明RHT-3201的给药和IL-12/IL-10比率关系的图。图22为表示在重度特应性皮炎模型中，本发明RHT-3201的给药和后背皮肤组织的病理学特征的肉眼观察结果(上端)，以及采集皮肤组织以及进行H&E染色并以电子显微镜观察的结果(下端)的图。图23为表示在重度特应性皮炎模型中，本发明RHT-3201的给药和背部皮肤组织的表皮厚度关系的图。图24为表示在重度特应性皮炎模型中，本发明RHT-3201的给药和背部皮肤组织的真皮厚度关系的图。图25为表示在重度特应性皮炎模型中，对本发明RHT-3201的给药和背部皮肤组织的肥大细胞浸润状态关系通过甲苯胺蓝染色进行观察的结果的图。图26为表示在重度特应性皮炎模型中，本发明RHT-3201的给药和背部皮肤组织的肥大细胞数目关系的图。具体实施方式下文中对本发明详细地进行说明。但是，下述实施例只是例示本发明，且不意图限制本发明的范围。<实施例1>对粘合剂种类的效果评估<1-1>多种粘合剂样品的制备在包含0.1～1％乳清粉末的MRS培养基上在37℃下培养鼠李糖乳杆菌IDCC3201(KCTC10833BP)24小时。之后通过离心法分离细菌和培养滤液，在培养滤液中分别以0.1％(w/v)的量添加透明质酸、藻酸盐、麦芽糊精、壳聚糖、聚乙二醇并搅拌1小时，之后浓缩，从而制备粘合剂，并对其进行冷冻干燥。各个样品用磷酸盐缓冲溶液稀释，以制备终浓度为1μg/ml的样品。使用脱脂乳粉作为对照组。<1-2>脾细胞的制备对5周龄雌性BALB/c小鼠，通过腹膜内注射推注2mg氢氧化铝和1mg卵清蛋白，经过6天后以相同方法进行第2次推注。在第13天时，从各小鼠中取出脾脏并提取脾脏细胞以制备脾脏细胞液。优选通过下述方法制备脾脏细胞。在无菌摘除的小鼠脾脏中滴加10ml汉克斯平衡盐溶液(HBSS)并在60目铁网上用镊子弄破以收集细胞悬浮液，然后置于2.5ml胎牛血清中，静置10分钟，从而使大块沉淀下来。之后将大块悬浮在NH4Cl溶液(pH7.0)中3-4分钟以使红细胞溶血，然后与2.5ml胎牛血清混合并以1500RPM离心5分钟。采用HBSS清洗沉淀物2次后，在含有10％胎牛血清和1mg/ml卵清蛋白的DMEM培养基中悬浮成5x106细胞/ml的浓度，从而制备脾脏细胞。<1-3>脾脏细胞的培养以及细胞因子的测量在96-孔板的各孔中添加200μl脾脏细胞悬浮液(5x106细胞/ml)和10μl(1μg/ml)实施例<1-1>中制备的各样品溶液，并在5％CO2培养基中培养7天。培养完毕后，利用Cytoset试剂盒(Biosource)测量培养液中的IL-4和IL-12。各样品的IL-4和IL-12生成作为如[表1]所述的相对于对照组的增加率来表示。[表1]粘合剂的确定实验结果表明，透明质酸粘合剂显示IL-4增加5％，IL-12增加52％。海藻酸钠粘合剂显示IL-4增加15％，IL-12增加29％，麦芽糊精粘合剂显示IL-4增加9％，IL-12增加36％，壳聚糖粘合剂显示IL-4增加17％，IL-12增加38％。聚乙二醇粘合剂显示IL-4增加13％，IL-12增加22％。因此，在使用多糖聚合物制备粘合剂时，IL-12的增加率相对高，而IL-4的增加率相对低。其中，透明质酸粘合剂显示最高的IL-12增加率以及相对低的IL-4增加率。在透明质酸之后，麦芽糊精、壳聚糖、海藻酸钠依次表现出好的结果。<实施例2>对粘合剂浓度的效果评估<2-1>不同浓度样品的制备在多糖聚合物中，以在实施例1中表现出最佳效果的透明质酸作为代表物质，进行了对粘合剂浓度的效果评估。在培养滤液中各自添加0.0001％～1％(w/v)的透明质酸后，搅拌1小时，然后将混合物减压浓缩，从而制备不同浓度的透明质酸粘合剂，并将这些粘合剂进行冷冻干燥。将各样品用磷酸盐缓冲溶液进行稀释以制备终浓度为1μg/ml的样品。使用脱脂乳粉作为对照组。<2-2>细胞因子生成实验采用和实施例<1-3>相同的方法，对实施例<2-1>中所制备的各粘合剂样品，研究了脾脏细胞的细胞因子生成率。其结果示于下述[表2]中。[表2]透明质酸添加浓度的确定实验结果如所述[表2]所示，用于制备透明质酸粘合剂的透明质酸的最佳浓度是0.001％(w/v)，此时IL-4的生成量相对于对照组减少，并且IL-12的生成量相对于对照组增加。<实施例3>对细菌热灭活条件的效果评估为了确定最佳的热灭活条件，优化了基于温度和时间的热灭活条件，并评估了其对Caco-2细胞的附着功能，从而选择最佳条件。更详细的实验方法如下。<3-1>热灭活细菌样品的制备将鼠李糖乳杆菌细菌在60℃至120℃下热灭活10分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟和60分钟(加热器，EYELAOSB-2100，中国)，并冷却到30℃，然后用作实验样品。将各样品用磷酸缓冲溶液清洗2次后，悬浮到1ml相同的缓冲溶液中，并在无血清DMEM中稀释成1x108细胞/ml，备用。<3-2>对肠道细胞的附着功能的评估通过以下方法制备Caco-2细胞单层：将Caco-2细胞(KoreanCellLineBank)以1.2x105细胞/ml浓度接种到添加有10％(v/v)胎牛血清和20μl/ml庆大霉素的达尔伯克(氏)改良伊格尔(氏)培养基(Dulbecco`sModifiedEagle`sMedium，DMEM)(Hyclone，USA)中，并使用6孔组织培养板在每个孔中分配1ml培养7天后，用磷酸缓冲溶液清洗2次。在形成了Caco-2细胞单层的各孔中加入1ml实施例<3-1>中制备的样品并反应90分钟。使用1mlDMEM代替热灭活的乳酸细菌作为对照组。反应后，除去上清液，添加1ml0.04％(w/v)吐温80以回收附着在Caco-2细胞上的热灭活乳酸菌，并使用血细胞计数器测定所观察到的菌数。通过附着菌数对初期菌数的比率计算附着效率。(参见表3)[表3]基于细菌热灭活条件的附着率如[表3]中所示，在80℃和60分钟的热灭活条件下，附着率最佳。这是由于在乳酸菌细胞壁中存在的脂磷壁酸等组成成分具有阻碍肠道内的有害菌如大肠杆菌和沙门氏菌附着在肠膜表面上，并且通过与作为肠膜细胞中树突细胞样受体中的一个TLR-2结合而参与人体肠道的免疫激活。因此，通过确定最佳细菌热灭活条件以使存在于细胞壁上的相关因子顺利排出，以便使与热灭活的乳酸菌与肠道内的常住菌群进行竞争的同时附着于肠道，并因此，最终激活肠道的免疫系统。<实施例4>与多糖塞合物缀合的热灭活鼠李糖乳杆菌的制备将<实施例2>中所制备的中浓缩的0.001％的透明质酸粘合剂——鼠李糖乳杆菌培养滤液在该透明质酸粘合剂中进行了浓缩——与<实施例3>中在80℃下热灭活60分钟所制备的细菌混合并反应。所得反应物与载体如作为赋形剂的淀粉混合，经过干燥过程，从而制备与多糖聚合物缀合的热灭活鼠李糖乳杆菌(以下标记为“RHT-3201”)。对如上所述制备的RHT-3201和作为益生菌的鼠李糖乳杆菌IDCC3201以与实施例<1-3>相同的方法进行免疫增强作用的相对比较(参见表4)。[表4]常规益生菌与本发明RHT-3201的免疫增强效果的比较如[表4]中所示，证实了本发明的RHT-3201乳酸菌相对于现有益生菌，调节参与Th1/Th2的细胞因子的效果高出17倍。这是由于在制备过程中将其制备成了可与肠道粘膜受体如TLR-2更好地结合的形式。<实施例5>通过电子显微镜(FE-SEM)的结构分析对于<实施例4>中所制备的RHT-3201的外观，根据各制备方法通过电子显微镜(FE-SEM，模型：LEOSUPRA55，GENESIS2000(CarlZeiss，EDAX))进行拍摄而进行结构分析。通过电子显微镜对所述RHT-3201的制备方法阶段性地进行结构分析并示出于[图1]至[图5]中。如[图1]和[图2]中所示，观察到在制备粘合剂的过程中，将鼠李糖乳杆菌IDCC3201与透明质酸混合，随后浓缩，可使透明质酸粒子变得更稠密以形成粘合剂结构(参见图2)。此外，如[图3]和[图4]中所示，观察到特定条件下，乳酸菌的细胞壁不会因细菌的热灭活而碎片化，但是具有能够容易地附着于肠道粘膜的暴露的结构(参见图4)。最后，将热灭活细菌与透明质酸混合以促进对肠道粘膜的附着(参见图5)。<实施例6>RHT-3201的批量生产在通过<实施例4>中的制备方法而批量生产RHT-3201时为了验证重现性，对益生菌和批量生产的RHT-3201的肠内附着率进行了比较(参见表5)。具体而言，鼠李糖乳杆菌IDCC3201在生产规模为1吨(ton)的发酵桶中在37℃下培养过夜。通过离心法分离培养滤液和细菌，在培养滤液中添加培养液体积0.001％(w/v)的透明质酸，之后在50℃下进行减压浓缩而制备粘合剂，该粘合剂待缀合于热灭活细菌表面。细菌在80℃下进行热处理60分钟而制备热灭活细菌。然后，将粘合剂和热灭活细菌混合、同质化并干燥，从而制备RHT-3201。作为对照而使用的鼠李糖乳杆菌IDCC3201益生菌是通过用于制备益生菌原料的常规方法制备的。具体地，从相同培养液获得细菌后，将其悬浮于20ml磷酸盐缓冲溶液中并进行冷冻干燥，从而制备细菌粉末。[表5]现有益生菌与本发明RHT-3201的附着率比较区分RHT-3201益生菌附着率(％)8554如所述[表5]中所示，证明了RHT-3201的附着率相对于鼠李糖乳杆菌益生菌改善了57％。<实施例7>摄入稳定性评估<7-1>酸稳定性乳酸菌制剂在穿过消化道的胃时暴露于胃酸中。在体外条件中重现这样的环境，对益生菌和本发明的RHT-3201的酸稳定性进行了比较。更具体地，将10％盐酸(HCL)滴入到MRS培养基中，并调整pH为2.3和2.5，然后，将所述MRS灭菌后备用。将各自为1g的益生菌和RHT-3201样品置入到pH-调整后的MRS培养基中，随后反应0小时、1小时、2小时。以与实施例<3-2>相同的方法测量Caco-2细胞的附着菌数，而进行附着率分析。此时，在实验中所使用的乳酸菌为鼠李糖乳杆菌IDCC3201。通过<实施例6>的制备方法而制备的RHT-3201和益生菌用于实验中。[表6]本发明的RHT-3201的酸稳定性测量结果如所述[表6]中所示，证明了相对于益生菌，即使暴露于酸中，本发明的RHT-3201也可以维持其附着效率。<7-2>胆汁稳定性胆汁酸进行如下肠道循环：在肝脏中生成并通过胆道流入小肠，然后再由小肠末端的回肠吸收95％并再次进入肝脏。胆汁酸影响进入小肠中的乳酸菌的附着功能。因此对益生菌和本发明RHT-3201在暴露于胆汁酸时的附着率进行了比较。更具体地，使用了经灭菌的添加了0.3％胆汁酸的MRS培养基和未添加0.3％胆汁酸的MRS培养基。然后，在各培养基中接种各自为1g的益生菌和本发明的RHT-3201并反应2小时。随后，以与实施例<3-2>相同的方法测量Caco-2细胞的附着菌数，而进行附着率分析。此时，在实验中所使用的乳酸菌为鼠李糖乳杆菌IDCC3201，通过<实施例6>的制备方法制备的RHT-3201和益生菌各自用于实验中。[表7]本发明的RHT-3201的胆汁稳定性检测结果如所述[表7]中所述，证明了在胆汁酸中暴露2小时时，RHT-3201可维持57％的附着效率，比益生菌的附着效率高约2.5倍。<实施例8>基于温度的经时稳定性评估<8-1>本发明的RHT-3201和益生菌在4℃下的经时稳定性比较实验在<实施例6>中所制备的本发明RHT-3201和益生菌在4℃下冷藏贮存365天后，随着时间的推移测量每1g原料的附着菌数并将结果记载于[表8]中。以与实施例<3-2>相同的方法进行附着菌数的测量，通过测量Caco-2细胞的附着菌数，进行附着率分析。[表8]本发明RHT-3201和益生菌在4℃下的经时稳定性比较实验<8-2>本发明的RHT-3201和益生菌在15℃下的经时稳定性比较实验在<实施例6>中所制备的本发明RHT-3201和益生菌在15℃下冷藏贮存365天后，随着时间的推移测量每1g原料的附着菌数并将结果记载于[表9]中。以与实施例<3-2>相同的方法进行附着菌数的测量，通过测量Caco-2细胞的附着菌数，进行附着率分析。[表9]本发明RHT-3201和益生菌的15℃经时稳定性比较实验<8-3>本发明的RHT-3201和益生菌在25℃下的经时稳定性比较实验在所述<实施例6>中制备的本发明RHT-3201和益生菌在25℃冷藏贮存365天后，随着时间的推移测量每1g原料的附着菌数并将结果记载于[表10]中。以与实施例<3-2>相同的方法进行附着菌数的测量，通过测量Caco-2细胞的附着菌数，进行附着率分析。[表10]本发明RHT-3201和益生菌在25℃下的经时稳定性比较实验<8-4>本发明的RHT-3201和益生菌在37℃下的经时稳定性比较实验在<实施例6>中所制备的本发明RHT-3201和益生菌在37℃冷藏贮存365天后，随着时间的推移测量每1g原料的附着菌数并将结果记载于[表11]中。以与实施例<3-2>相同的方法进行附着菌数的测量，通过测量Caco-2细胞的附着菌数，进行附着率分析。[表11]本发明RHT-3201和益生菌在37℃下的经时稳定性比较实验<实施例9>在诱发轻度壁应性皮炎的体外模型中，本发明RHT-3201对细胞因子生成的调节。在诱发特应性皮炎的小鼠模型中，对从相同乳酸菌生成的本发明RHT-3201、一种益生菌制剂以及一种死菌制剂进行效果评估，具体实验方法如下。<9-1>样品的制备使用在包含0.1～1％乳清粉末的MRS培养基中在37℃下培养鼠李糖乳杆菌IDCC320124小时而制备的培养液，并使用与<实施例6>相同的方法制备本发明的RHT-3201和益生菌制剂。死细菌通过以下方法制备：从培养液中获取细菌，将其悬浮于500μl磷酸盐缓冲溶液中并通过冷冻干燥法进行干燥。对干燥的细菌称重，并将其以300mg/ml的浓度悬浮于无菌磷酸盐缓冲溶液中。将悬浮液在100℃下热处理30分钟，从而将细菌杀死。将所述三种类型的样品用磷酸盐缓冲溶液稀释以制备1μg/ml的最终样品。使用脱脂乳粉作为对照组。<9-2>脾脏细胞的培养以及细胞因子的测量使用与<实施例1-2>相同的方法制备脾脏细胞。在96-孔板的各孔中添加200μl脾脏细胞悬浮液(5x106细胞/ml)和10μl(1μg/ml)<实施例9-1>中所制备的各样品溶液，并在5％CO2培养基中培养7天。培养完毕后，利用Cytoset试剂盒(Biosource)检测培养液中的IL-4和IL-12。各培养液中IL-4、IL-12生成的程度，表示为相对于对照组的增加率，如[表12]中所示。[表12]随着乳酸菌的添加而从脾脏细胞生成的细胞因子的增加率如实验结果所示，鼠李糖乳杆菌IDCC3201益生菌组中，IL-4增加了20％，IL-12增加了29％。死菌组中，IL-4增加了12％，IL-12增加了34％。RHT-3201组中，IL-4增加了3％，IL-12增加了67％。因此，证明了本发明RHT-3201显示出IL-12生成的显著增加并且IL-4的生成的相对轻微的增加，因此，具有最佳的细胞因子生成调节效果。<实施例10>在诱发重度壁应性皮炎的体外模型中，本发明RHT-3201的治疗效果。<10-1>实验材料和诱导抗原的制备使用本发明RHT-3201作为实验材料，使用类固醇类药物地塞米松(SigmaCo.Ltd)作为阳性对照，地塞米松是治疗重度特应性皮炎的主要药物。作为引起特应性皮炎的物质使用了屋尘螨(HouseDustMite)中的主要种——粉尘螨(Dermatophagoidesfarina)的提取物，该提取物以软膏形式从中央实验动物公司(CentralLab.AnimalInc.)购买使用。将地塞米松溶解于乙醇中，并配制成0.1％(w/v)的浓度，将本发明RHT-3201溶解于蒸馏水中，并分别配制成1x108CFU/0.5ml/小鼠、1x109CFU/0.5ml/小鼠、1x1010CFU/0.5ml/小鼠的剂量。所有待给药的样品在实验当天制备。地塞米松以每周2次、每一个体100μl的量涂布到皮肤上，使用小鼠探针将本发明RHT-3201以每日1次、每一个体0.Sml的量口服给药。正常组和特应性对照组口服给予蒸馏水，所有实验组给药8周。<10-2>实验动物的准备以及饲养从中央实验动物购买雌性NC/Nga6周龄小鼠，适应1周后使用。饲养环境维持恒温(22±2℃)和恒湿(50～60％)并以12小时的间隔调整光周期(08∶00～20∶00)和暗周期(20∶00～08∶00)。动物以每个聚砜笼三只动物的方式分离饲养，并24小时自由摄取实验食物和水。<10-3>重度特应性皮炎的诱发将7周龄的NC/Nga小鼠的背部至耳朵背部的毛完全剃掉后，在脱毛部位上喷洒150μl4％十二烷基硫酸钠(SDS)。在完全干燥后，将10mg尘螨(螨提取物)软膏均匀地涂布在脱毛部位上。通过每周2次持续3周、总共6次的尘螨(螨提取物)软膏涂布，诱发中度至重度皮炎。之后，在实验组给药期间(8周)，通过每周1次的涂布维持重度特应性皮炎。[表13]采用实验材料处理前在各模型中诱发重度特应性皮炎的评分如[表13]中所示，通过对NC/Nga小鼠涂布尘螨(螨提取物)软膏3周而诱发特应性皮炎，因此，完成了各组评分为10分以上的患有重度特应性皮炎NC/Nga小鼠。<10-4>特应性皮炎的评估在本评估中，使用特应性皮炎评分(SCORAD)——一种通常用于特应性皮炎的临床肉眼评价方法，将特应性皮炎的严重程度表示为5个项目的评估得分总和。所述项目为红斑，皮肤干燥，水肿，抓痕和苔癣样变(Lichenification)。对各个项目以无症状(0分)、轻度症状(1分)、中度症状(2分)、严重症状(3分)进行评分后，将5个项目的得分相加，在最低分0分(无症状的状态)至最高分15分(全部项目均为严重的状态)之间确定评估分数。每周评估小鼠皮肤病损的严重程度(参见图6)。在[图6]中，媒介物是患有尘螨-诱发的重度特应性皮炎的小鼠组的结果，地塞米松是使用阳性对照药地塞米松进行8周的皮肤涂布后的小鼠组的结果，RHT-320110^8、RHT-320110^9、RHT-320110^10是对患有尘螨-诱发的重度特应性皮炎的小鼠组给予不同浓度的本发明RHT-3201的结果：RHT-320110^8是以1x108CFU/小鼠的浓度经过8周口服给药的结果，RHT-320110^9是以1x109CFU/小鼠的浓度经过8周口服给药的结果，RHT-320110^10是以1x1010CFU/小鼠的浓度经过8周口服给药的结果。作为经过8周的治疗后缓解重度特应性皮炎的效果的研究结果，来自[图6]的结果证明了，没有进行任何药物治疗的媒介物组的重度特应性皮炎分数平均为8.0，表明维持了初期的重度状态。当与患有尘螨-诱发的重度特应性皮炎的小鼠组(媒介物)比较时，在分别采用RHT-320110^8、RHT-320110^9和RHT-320110^10处理的所有组中，小鼠皮肤病损的严重程度的评估显著地降低。更具体地，RHT-320110^8给药组的重度特应性皮炎得分为4.2，显示出47.5％的重度特应性皮炎改善效率。RHT-320110^9给药组的重度特应性皮炎得分为2.3，显示出71.25％的重度特应性皮炎改善效率。RHT-320110^10给药组的重度特应性皮炎得分为2.7，显示出66.25％的重度特应性皮炎改善效率。通常已知的是需要摄取大量的乳酸菌制剂，而没有关于获得乳酸菌制剂对重度特应性皮炎的改善效果的最佳浓度的报告。原因在于乳酸菌益生菌通过胃肠道时，被胃酸和胆汁酸大量杀灭使起免疫作用的肠道粘膜附着效率降低并被排出体外。与此不同，本发明RHT-3201在不同浓度下的治疗效果显著，并且x109摄取单位和x1010摄取单位在重度特应性皮炎改善效率方面显示出误差范围内的相似性。原因在于与分布在肠道粘膜树突细胞上的Toll样受体的结合数饱和而显示阈值。[图7]是乳酸杆菌RHT-3201口服给药对重度特应性皮炎的效果的肉眼观察结果。在媒介物组的皮肤病损中，可清楚地观察到皮肤干燥、红斑、水肿、苔癣样变以及由瘙痒症引起的持续抓挠的抓痕。在所有浓度的RHT-3201给药组中，肉眼观察证实了特应性皮炎症状的改善。<10-5>抓挠行为以及体重测量在给予实验药物第一周开始，每周1次持续15分钟对抓挠行为进行计数。为了避免除了由瘙痒症以外的其他原因而引起的抓挠行为，仅对使用后腿进行的抓挠行为进行了计数。同时，在诱发重度特应性皮炎时，由于药物的副作用和应激会出现体重的减少。为了证实本发明的实验药物是否引起体重减少的副作用，在给药期间测量了实验动物的体重。如[图8]中所示，在8周期间，所测量的所有实验物质给药组的抓挠行为为100次/小时以下，与媒介物组相比，每周都显示抓挠行为减少的趋势。在第3、6、8周时，与媒介物组相比，所有浓度的RHT-3201给药组中显示了显著性。此外，如[图9]中所示，在8周期间，作为阳性对照的地塞米松的经皮给药引起体重减轻并持续4周，但本发明RHT-3201的给药显示出与正常组相同模式的体重增加，没有引起体重减轻，并因此证实了本发明RHT-3201的安全性。<10-6>血清IgE水平的测量给予实验药物8周后，通过眼后静脉丛进行采血，并对所采取的血在12000RPM下离心10分钟而分离血清。使用ELISA试剂盒(SHIBAYAGI，日本)测量血清中的IgE水平。如[图10]中所示，对于已知在诱发重度特应性皮炎时明确地增加的IgE，本发明RHT-3201给药显示出了显著的抑制效果，特别是在不同给药浓度比较中，x109摄取单位中显示出了最高的抑制效果。<10-7>淋巴结细胞产生细胞因子的能力实验药物给药完毕后，将已诱发重度特应性皮炎的各NC/Nga小鼠处死，并测量了腋窝淋巴结的大小以及重量。此外，将从所述腋窝淋巴结获得的细胞悬浮液分配于RPMI-1640培养基(含有10％FBS、1％青霉素和1％链霉素)至5x106细胞/ml的浓度。加入尘螨(D.farina)提取物至最终浓度为10μg/ml，并在5％CO2培养箱中在37℃下培养48小时。获取上层液，并使用ELISA试剂盒(IFN-γ和IL-4的生产商：R&DSYSTEMS，USA；IL-10和IL-12的生产商：SIGMAALDRICH，USA)测量IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-12的生成量。如[图11]中所示，腋窝淋巴结参与NC/Nga小鼠背部皮肤的免疫应答，由于暴露于尘螨(螨提取物)抗原，媒介物组的淋巴结扩大。如[图12]和[图13]中所示，淋巴结的体积和重量的测量值分别为70mm3和35mg，比正常组高出了5倍和7倍。然而，在本发明RHT-3201的给药组中，诱发了重度特应性皮炎的NC/Nga小鼠的腋窝淋巴结的大小显著减小。为了证实随着RHT-3201的给药的细胞因子的生成性能，使诱发了重度特应性皮炎的NC/Nga小鼠的腋窝淋巴结中暴露尘螨抗原，然后，测量参与免疫应答的细胞因子的水平。结果示于[图14]至[图21]中。证实了Th1型细胞因子IFN-γ(参见图14)及其诱导剂IL-12(参见图15)随着本发明RHT-3201的给药相对于媒介物显著地减少。还证实了Th2型细胞因子IL-4也随着本发明RHT-3201的给药相对于媒介物显著地减少(图16)。存在于淋巴结中的IL-10的主要分泌细胞是调节性T细胞(Treg)，其起到抑制Th1和Th2反应的免疫抑制作用。还证实了IL-10也随着本发明RHT-3201的给药相对于媒介物显著地减少(图17)。为了对本发明RHT-3201对重度特应性皮炎的作用机制进行比较，将各给药组中显示的细胞因子的水平采用Th1型细胞因子/Th2型细胞因子的方式显示。其结果，如[图18]中所示，相对于媒介物组，IL-4/IFN-γ比率在RHT-3201各给药组之间没有差异。这些结果与<实施例9>中本发明的RHT-3201对轻度特应性皮炎的Th1型细胞因子/Th2型细胞因子的调节反应不同，表明本发明的RHT-3201对重度特应性皮炎具有不同的作用机制。即，证实了基于特应性皮炎的症状严重程度，本发明RHT-3201的作用机制也不同。为了证实本发明的RHT-3201对重度特应性皮炎的的其他作用机制是由于参与抑制调节性T细胞(Treg)的细胞因子IL-10这一作用因子，对IFN-γ/IL-10比率(参见图19)、IL-4/IL-10比率(参见图20)、IL-12/IL-10比率(参见图21)进行比较和分析。结果证实了在本发明RHT-3201给药组中，所述比率数值显著降低。因此，表明参与重度特应性皮炎治疗的作用因子是IL-10，并且该细胞因子通过增加调节性T细胞(Treg)的活性而发挥重度特应性皮炎的治疗效果。<10-8>组织病理学观察收集NC/Nga小鼠的背部皮肤，将其固定在10％福尔马林中，进行石蜡包埋，并薄切至4μm的厚度，从而制备切片。之后，通过苏木精和伊红(H&E)染色观察表皮和真皮的厚度变化，采用甲苯胺蓝染色证实肥大细胞。使用光学显微镜在100倍和400倍的放大率下进行观察并计算皮肤厚度以及肥大细胞数。对NC/Nga小鼠的背部皮肤进行H&E染色并观察的结果，如[图22]中所示，与正常组相比，由于暴露于尘螨而诱发特应性皮炎的媒介物组显示以下组织病理学发现：由表皮层朝向真皮层的增厚引起的线粒肿和炎症细胞的渗透性增加。本发明RHT-3201的给药组在以显微镜观察时，显示了降低的炎症细胞浸润；并证实了与媒介物组相比，在诱发特应性皮炎时所观察到的表皮厚度扩张(参见图23)和真皮厚度扩张(参见图24)的显著抑制。对NC/Nga小鼠的背部皮肤用甲苯胺蓝染色并观察到的结果，证实了，与正常组相比，在由于暴露于尘螨——一种诱发特应性皮炎的抗原材料——而诱发特应性皮炎的媒介物组中，肥大细胞浸润至皮肤组织中的量更多(参见图25)。在重度特应性皮炎的情况中，肥大细胞数通常会随着重度特应性皮炎的阶段而增加。如[图26]中所示，证实了在暴露于尘螨11周的小鼠(媒介物)的皮肤组织中，肥大细胞数增加，而在诱了重度特应性皮炎的小鼠中，在给予8周RHT-3201的组中，肥大细胞数显著减少。因此，认为本发明的RHT-3201显示缓解重度特应性皮炎的显著效果。[工业实用性]如上所述，本发明涉及一种与多糖聚合物粘合剂缀合的热灭活鼠李糖乳杆菌及其制备方法和用途，本发明的与多糖聚合物粘合剂缀合的热灭活鼠李糖乳杆菌对特应性疾病的治疗效果显著，特别是显著地改善了现有的乳酸菌剂所具有的肠道粘膜附着竞争力，显示出与类固醇类药物相同水平的预防、改善或治疗特应性皮炎的效果，因此具有很高的工业实用性。当前第1页1 2 3