一种除草剂2,4-d的降解菌株及其生产的菌剂和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物领域，提供一种除草剂2, 4 -D的降解菌株及其生产的菌剂和应 用。 技术背景
[0002] 有机氯农药是20世纪80年代前应用的最主要和最有效的农药品种之一，由于其 具有价格低廉，高效广谱等特点，在世界范围内得到了广泛应用。而其中的苯氧乙酸类除草 剂更是以其成本低，速度快等优势被大规模生产和使用。2, 4 -D (2, 4-二氯苯氧乙酸；2, 4-Dichlorophenyloxy acetic acid)是具有代表性的合成植物生长素的物质，同时也是一种 常用的除草剂，在农林业中发挥了重大作用，尤其在水果（如柑橘）保鲜中应用广泛。在 30ppm以下低浓度时2, 4 -D可作为植物生长调节剂，在500ppm以上高浓度时则可用作除草 剂，可从根、茎、叶进入植物体内。2, 4-D降解缓慢，且吸附性强，所以极易残留。因此，其毒 性问题受到了广泛关注。此外，由于2, 4 -D残留导致的下茬作物药害问题也造成严重经济 损失，影响粮食安全。大量研宄都表明利用微生物来降解消除土壤中的除草剂残留，从而解 除下茬作物药害，保障粮食安全，保护生态环境是可行的。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于针对目前日益严重的土壤中残留的除草剂2, 4 -D，开发研制出 一种新型的2, 4 -D除草剂残留降解菌剂，使用本菌剂可以使土壤中2, 4 -D、二甲四氯两种 除草剂的残留量降低90%以上，生产和使用成本较低。使用该降解菌剂可以有效解除下茬 作物药害，保障下茬作物良好生长。
[0004] 本发明的目的可通过以下技术方案实现：
[0005] -株除草剂2, 4 -滴降解菌株LZ35, 2015年4月15日保藏于中国典型培养物保 藏中心，菌种保藏号为CCTCCN0:M2015235。。经鉴定LZ35属无色杆菌属（Achromobacter sp.)，主要生物学特性为G_，菌体为杆状，大小约0. 4 - 0. 7ym宽，1. 4 - 2. 8ym长，好氧；过 氧化氢酶、氧化酶和V.P.反应为阳性；B引哚反应阴性；不能水解淀粉，能氧化葡萄糖产酸， 使石蕊牛乳酸凝固，能抗氨苄青霉素、卡那霉素、庆大霉素、链霉素、氯霉素、四环素、壮观霉 素和红霉素，该菌株16SrRNA基因的GenBank登录号为KP996670。
[0006] 本发明所述的除草剂2, 4 -D降解菌株LZ35在降解除草剂2, 4 -D中的应用。
[0007] 本发明所述的除草剂2, 4 -D降解菌株LZ35在制备降解除草剂2, 4 -D的菌剂中 的应用。
[0008] -种用本发明所述的除草剂2, 4 -D残留降解菌株LZ35生产的降解菌剂。
[0009] 所述的降解菌剂优选通过以下方法生产而成：
[0010] 1)将所述的除草剂2, 4 -D降解菌株LZ35试管种接种于肉汤培养基摇瓶中，振荡 培养至对数期；
[0011] 2)将上述培养好的菌种按10%的接种量接种入种子罐，培养至对数生长期，种 子罐所用的培养基配方为：葡萄糖 0.8%，（NH4)2S041%，K2HP040.2%，MgS040.05%，NaCl0? 01%，CaC030. 3%，酵母膏 0? 02%，pH值 7. 2 - 7. 5 ;
[0012] 3)将种子液按10%的接种量接入生产罐培养，生产罐所用培养基与种子罐培养 基相同；
[0013] 4)发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体制剂或采用泥 炭吸附用包装袋分装成固体菌剂制剂；
[0014] 其中，在种子罐和生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1 :0. 6 - 1. 2,搅拌速 度为180 - 240转/分，培养温度为30 - 35°C，全流程培养时间为36 - 48小时，发酵结 束后菌体数量达到10亿个/ml以上。
[0015] 本发明所述的菌剂在降解除草剂2, 4 -滴中的应用，优选在降解土壤中残留的除 草剂2, 4 -滴中的应用。
[0016] 有益效果
[0017] 使用该发明生产的2, 4 -D除草剂残留降解菌剂具有生产使用成本低，使用方便， 去除土壤中残留2, 4 -D效果好的优点，适合于2, 4 -D使用后下茬作物产生药害的地区推 广使用。本发明对于保护生态环境，保护人民的身体健康具有重要的意义。降解菌株LZ35 在以2, 4 -D，二甲四氯为唯一碳源的无机盐培养基中，按1%的接种量接入降解菌株LZ35， 于30°C，振荡培养24小时后，取样测定降解率，从结果中可以看出，降解菌LZ35对这两种除 草剂的降解率都在90%以上，具有很好的降解效果，并且该菌为革兰氏阴性菌，而且抗逆性 强，在田间的存活时间适当，不会影响以后除草剂的使用效果。
[0018] 用本发明产品在实验室进行盆钵进行残留除草剂的降解效果试验。从表1中可以 看出经降解菌处理后能显著降低土壤中残留除草剂对玉米植株的药害，菌株在土壤中定植 能力强，能够显著降解土壤中的残留的除草剂，对后茬作物药害的解除具有巨大的应用前 景（见实施例3)。
[0019] 本发明成功地解决了农业生产中除草剂残留导致下茬作物药害的问题，既充分发 挥了化学除草剂在植物杂草防治中的高效快速的作用，又可以充分解除对后茬作物的药 害，保障粮食安全。
【附图说明】
[0020] 图1: 土壤中2, 4 -滴浓度为50ppm时对玉米植株生长的药害实验，处理为加入 LZ35降解菌剂对2, 4 -滴药害的解除实验，空白对照为土壤中不加2, 4 -滴的实验。
[0021] 图2:土壤中2, 4 -滴浓度为lOOppm时对玉米植株生长的药害实验，处理为加入 LZ35降解菌剂对2, 4 -滴药害的解除实验，空白对照为土壤中不加2, 4 -滴的实验。
[0022] 图3 :土壤中2, 4 -滴浓度分别为50ppm和lOOppm时对玉米植株生长的药害实验， 处理为加入LZ35降解菌剂对2, 4 -滴药害的解除实验，空白对照为土壤中不加2, 4 -滴的 实验。
[0023] 图4:菌株LZ35对玉米植株在浓度为50ppm的2, 4 -D土壤中生长的残留药害的 解除作用比较，包括对玉米植株根，莖，叶的影响比较。
[0024] 图5:菌株LZ35对玉米植株在浓度为lOOppm的2, 4 -D土壤中生长的残留药害的 解除作用比较，包括对玉米植株根，莖，叶的影响比较。
[0025] 图6,菌株LZ35对玉米植株在浓度分别为50ppm和lOOppm的2, 4 -D土壤中生长 的残留药害的解除作用比较，包括对玉米植株根，莖，叶的影响比较。
[0026] 图7.在实验室条件下，将菌株LZ35接种到含有2, 4 -D终浓度为50ppm无机盐液 体培养基中，30°C培养3天后，直接取lml液体培养基，离心取上清后用紫外分光光度计进 行检测。对照为只加有2,4 -D终浓度为50ppm无机盐液体培养基。
[0027] 图8:在实验室条件下，将菌株LZ35接种到含有2, 4 -D终浓度为50ppm无机盐液 体培养基中，30°C培养3天后，直接取lml液体培养基，离心取上清过0. 22ym水相滤膜后 用HPLC进行检测。对照为只加有2, 4 -D终浓度为50ppm无机盐液体培养基。
[0028]图9:在实验室条件下，调节菌株LZ35在液体无机盐培养基中初始0D_至0. 1，其 降解起始浓度为200ppm的2, 4 -D对时间作的降解曲线。Control为不加菌体的对照。
[0029] 生物材料保藏信息
[0030] 除草剂2, 4 -D降解菌株LZ35,分类命名为Achromobactersp.LZ35,保藏于中国 典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏日期为2015年4月15日，保藏 编号CCTCCNO:M2015235。
【具体实施方式】
[0031] 实施例1
[0032] 本发明提供一种能高效降解（矿化）2,4 -D的菌株及其生产的菌剂，所用菌株为 革兰氏染色阴性菌LZ35,分离自江苏昆山绿利来农药厂厂区的土壤中。菌株具体的分离筛 选方法为：取土样5. 0g加入到100ml添加0. 1 %酵母粉的无机盐液体培养基中，加2, 4-D 终浓度为50ppm，在30°C条件下进行富集培养，摇床转速为150rpm?mirT1，每隔7d以10% 的接种量接种至新鲜的无机盐液体培养基中，连续传代培养3次。然后以1 %的接种量接种 至加有2, 4 -D终浓度为50ppm的新鲜的20ml无机盐液体培养基中，培养5d。用紫外扫描 仪和液相色谱同时检测2, 4 -D含量