一种重组酵母菌株及其构建方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程技术领域，更具体的说是涉及一种重组酵母菌株及其构建方 法和应用。
【背景技术】
[0002] 在世界范围内，随着经济水平和对健康需求的提高，食品的安全性、营养性和功能 性受到越来越多的关注，因此功能性营养化学品已成为发展趋势，代表当代食品发展的新 潮流，具有广阔的市场前景。胡萝卜素是一种橘黄色脂溶性天然食用色素，具备极强的 抗氧化能力，是近年来国际上功能食品成分研宄的热点。
[0003] 0 _胡萝卜素的制备主要依赖植物提取、化学合成和微生物合成，前两种方法各有 其自身的不足，微生物合成则以低成本、高产量和产品安全性，被认为是最有前途的方法。 目前，在微生物合成胡萝卜素的研宄中，所采用的宿主菌主要集中于大肠杆菌与酿酒 酵母。2013年，通过上调内源MEP途径中的关键基因并在胞内组合搭建异源MVA路径，最 终通过分批补料发酵优化实现2.47g/L(72mg/gDCW)的胡萝卜素产量，属目前公开报道 的重组菌株中单位细胞产量最高。2014年，Yang等人也通过类似策略在大肠杆菌中实现 3. 2g/L的胡萝卜素产量。同年，天津工业生物技术研宄所马延和课题组通过组合优化 胞内MEP模块、ATP合成模块、PP路径及TCA循环，获得一株高产0 -胡萝卜素的重组大肠 杆菌，其在分批补料发酵罐上的产量为2.lg/L(60mg/gDCW)。
[0004] 酿酒酵母作为公认的安全模式微生物，相比大肠杆菌，它的菌体维生素、蛋白质含 量高，可作食用、药用和饲料酵母；相比三孢布拉氏霉菌，它的生长周期更短且更易培养。 因此，实现胡萝卜素在酿酒酵母中的高产将会在类胡萝卜素产业化上展现极大的竞争 力。然而，截至目前公开报道的利用重组酿酒酵母合成胡萝卜素的产量比起重组大肠 杆菌依然存在很大的差距。2013年以前报道的在酿酒酵母中合成胡萝卜素的产量最高 仅有6. 29mg/gDCW。2013年，Reyes等人以过氧化氢作为筛选压力，通过短期进化将胡 萝卜素的产量提高3倍，达到18mg/gDCW。与此同时，浙江大学于洪巍课题组应用诱导表达 系统在酿酒酵母中实现llmg/gDCW(7. 41mg/gDCW0 -胡萝卜素）的总类胡萝卜素产量；随 后，该课题组通过下调ERG9等一系列优化手段，并通过发酵优化将总胡萝卜素的产量提高 到1156mg/L(20. 79mg/gDCW)，但其中0 -胡萝卜素的所占比例较低，仅占总产量的30 %。因 此，亟待开发高纯度、高产胡萝卜素的重组酿酒酵母菌株。
【发明内容】
[0005] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种重组酵母菌株，使得所述重组菌株能够应 用于胡萝卜素的生物合成中，并保持较高产量，同时提供所述重组菌株的构建方法。
[0006] 为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
[0007] -种重组酵母菌株，所述酵母基因组敲除gall、gal7、gall0和ypl062w基因，且包 含经酵母自身同源重组整合到其基因组上的如下基因片段：
[0008] 酵母trpl位点上游同源序列、CYC1终止子、BtcrtI、GAL10启动子、GAL1启动子、 PacrtB、PGKl终止子、酵母trpl位点下游同源序列顺次拼接而成的基因片段1;
[0009] 酵母ypl062w基因上游同源序列、DR-K1URA3-DR营养标签、CYC1终止子、Bt crtI、GAL10启动子、GAL1启动子、PacrtB、PGKl终止子以及酵母ypl062w基因下游同源序 列顺次拼接而成的基因片段2;
[0010] 酵母1eu2位点上游同源序列、LEU2标记、TDH2终止子、ACT1终止子、截短的 HMG-CoA还原酶基因tHMGRl、GAL10启动子、GAL1启动子、TmcrtE、GPMl终止子、酵母leu2 位点下游同源序列顺次拼接而成的基因片段3 ;
[0011] 基因片段3中TDH2终止子及其上游同源序列、DR-K1URA3-DR营养标签、CYC1终 止子、BtcrtI、GAL3启动子、基因片段3中ACT1终止子及其下游同源序列顺次拼接而成的 基因片段4;
[0012] 酵母his3位点上游同源序列、HIS3标记、EN02终止子、ACT1终止子、截短的 HMG-CoA还原酶基因tHMGRl、GAL10启动子、GAL1启动子、融合基因BTS1-ERG20、FBA1终止 子、酵母his3位点下游同源序列顺次拼接而成的基因片段5 ;
[0013]酵母YGLCtau3位点上游同源序列、hphA抗性标签、IDI1终止子、基因IDI1、 GAL7启动子、TOC1终止子、SaPMK、GAL10启动子、GAL1启动子、SaMK、HXI7终止子、酵母 YGLCtau3位点下游同源序列顺次拼接而成的基因片段6 ;
[0014] 酵母gal7基因下游同源序列、nat抗性标签、ERG13终止子、基因ERG13、GAL7启 动子、ERG19终止子、基因ERG19、GAL10启动子、GAL1启动子、基因ERG10及其终止子、酵母 gall基因下游同源序列顺次拼接而成的基因片段7 ;
[0015] 酵母YMRWdeltal5位点上游同源序列、GAL1启动子上游激活序列UAS、GAL1启 动子、成团泛菌来源或杜氏盐藻来源或雨生红球藻来源的crtY基因、ADH1终止子、DR-K1 URA3-DR营养标签、YMRWdeltal5位点下游同源序列顺次拼接而成的基因片段8 ;
[0016] 酵母YNRCdelta9位点上游同源序列、GAL1启动子上游激活序列UAS、GAL1启动 子、成团泛菌来源或杜氏盐藻来源或雨生红球藻来源的crtY基因、ADH1终止子、DR-K1 URA3-DR营养标签、YNRCdelta9位点下游同源序列顺次拼接而成的基因片段9。
[0017] 本发明通过利用特定的酵母内源基因以及外源基因进行基因元件、基因模块的构 建，并转入到敲除gall、gal7、gall0和ypl062w基因的酵母基因组上，实现重组菌株|3 -胡 萝卜素的合成产量提高。
[0018] 其中，所涉及的酵母内源基因包括3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A(HMG-CoA) 合酶基因ERG13、乙酰乙酰辅酶A转乙酰酶ERG10、截短的HMG-CoA还原酶基因tHMGRl、焦磷 酸甲羟戊酸脱羧酶基因ERG19、法尼基焦磷酸（FPP)合酶基因ERG20、香叶基香叶基焦磷酸 (GGPP)合酶基因BTS1以及异戊烯基焦磷酸异构酶基因IDI1，上述基因的获得可以酵母基 因组为模板，通过PCR扩增获得；
[0019] 同时，本发明还涉及采用酵母中的氨基酸标记、启动子和终止子，包括CYC1终止 子、GAL10启动子、GAL1启动子及其上游激活序列UAS、PGK1终止子、ACT1终止子、GPM1终 止子、LEU2标记、TDH2终止子、FBA1终止子、EN02终止子、HIS3标记、IDI1终止子、HXI7终 止子、ERG13终止子、ERG19终止子、ERG10终止子、ADH1终止子，上述基因元件的获得也可 以酵母基因组为模板，通过PCR扩增获得；
[0020] 在本发明中，上述各基因元件以及相关的上下游同源序列以酿酒酵母菌株BY4741 的基因组为模板，设计并合成合适的引物，通过PCR扩增得到；而LEU2上游同源序列及 LEU2标记是一并从质粒pRS405上PCR扩增下来，HIS3上游同源序列及HIS3标记是一并从 质粒PRS313上PCR扩增下来。
[0021] 本发明所涉及的外源基因包括来源于金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureu) 的甲羟戊酸激酶基因SaMK、磷酸甲羟戊酸激酶基因SaPMK，以及不同来源的用于合成 0 -胡萝卜素的四种基因：GGPP合酶基因crtE、八氢番茄红素合成酶基因crtB、八氢番茄 红素脱氢酶基因crtl以及番茄红素环化酶基因crtY。选取特定来源的合成番茄红素的 功能基因集（crtE、crtB、crtl)与三种不同来源的crtY进行组合，具体为曼地亚红豆杉 (Taxusxmedia)来源的TmcrtE、成团泛菌（Pantoeaagglomerans)来源的PacrtB、三 抱布拉氏霉菌（Blakesleatrispora)来源的Btcrtl、成团泛菌（Pantoeaagglomerans) 来源的PacrtY、杜氏盐藻（Dunaliellasalina)来源的DscrtY以及截短的雨生红球藻 (Haematococcuspluvialis)来源的HpcrtY，上述基因均为经过密码子优化并适当规避常 用限制性酶切位点后通过人工合成得到。此外，本发明所用抗性标签也通过人工合成得到。
[0022] 作为优选，所述基因片段1-9序列为：
[0023] 基因片段1如SEQIDNO: 1所示、基因片段2如SEQIDNO:2所示、基因片段3 如SEQIDNO: 3所示、基因片段4如SEQIDNO:4所示、基因片段5如SEQIDNO: 5所示、 基因片段6如SEQIDNO:6所示、基因片段7如SEQIDNO: 7所示、基因片段8如SEQID N0:8-10任意一项所示、基因片段9如SEQIDNO: 11-13任意一项所示；
[0024] 其中，包含杜氏盐藻来源crtY基因的基因片段8如SEQIDNO:8所示；包含雨生 红球藻来源crtY基因的基因片段8如SEQIDNO:9所示；包含成团泛菌来源crtY基因的 基因片段8如SEQIDNO:10所示；
[0025] 包含杜氏盐藻来源crtY基因的基因片段9如SEQIDNO: 11所示；包含雨生红球 藻来源crtY基因的基因片段9如SEQIDNO: 12所示；包含成团泛菌来源crtY基因的基因 片段9如SEQIDNO: 13所示。
[0026] 更优选地，所述酵母包含经酵母自身同源重组整合到其基因组上的SEQID NO: 1-7所示核苷酸序列、SEQIDNO:8所示核苷酸序列以及SEQIDNO: 11所示核苷酸序 列；或包含经酵母自身同源重组整合到其基因组上的SEQIDNO: 1-7所示核苷酸序列、SEQ IDN0:9所示核苷酸序列以及SEQIDNO: 12所示核苷酸序列；或包含经酵母自身同源重组 整合到其基因组上的SEQIDNO: 1-7所示核苷酸序列、SEQIDNO: 10所示核苷酸序列以及 SEQIDNO: 13所示核苷酸序列。进一步优选，上述包含SEQIDNO: 1-7所示核苷酸序列、 SEQIDNO: 10所示核苷酸序列以及SEQIDNO: 13所示核苷酸序列的重组酵母菌株，保藏编 号为CGMCCNo. 10753,在本发明中记为SyBE_Sc0014CY06。
[0027] 作为优选，所述酵母为酿酒酵母、解脂属酵母或克鲁维属酵母。除此之外，也可以 以藻类、霉菌（如链霉菌等）和细菌（如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等）为改造菌株将本发明 所限定的基因元件和模块根据这些菌株的已被解析的类胡萝卜素生物合成路径来重组。
[0028] 更优选地，所述酿酒酵母为CEN.PK系列酿酒酵母或BY系列酿酒酵母。进一步优 选地，所述CEN.PK系列酿酒酵母为酿酒酵母CEN.PK2-1C。
[0029] 本发明所述重组酵母菌株能够大量的合成0 _胡萝卜素，因此本发明还提供了所 述重组酵母菌株在生产胡萝卜素中的应用以及在生产以胡萝卜素为中间产物的产 品（如虾青素）中的应用。
[0030] 此外，本发明还提供了所述重组酵母菌株的构建方法，包括：
[0031] 步骤1、构建由酵母gal7基因下游同源序列、DR-K1URA3-DR营养标签、gall基因 下游同源序列顺次连接的敲除盒片段1，以及由ypl〇62w基因上游同源序列、kanMX抗性标 签、ypl062w基因下游同源序列顺次连接的敲除盒片段2,利用敲除盒片段1和2通过酵母 自身同源重组敲除酵母gall、gal7、gallO和ypl062w基因，获得四敲基因酵母，备用；
[0032] 将酵母trpl位点上游同源序列、CYC1终止子、BtcrtI、GAL10启动子、GAL1启动 子、PacrtB、PGKl终止子、酵母trpl位点下游同源序列顺次拼接，获得基因片段1 (基因片 段模式图见图1)，即trpl位点上游同源序列-iCTa-crtl-PcAua-PcAu-crtB-Tpo^-trpl位点下 游同源序列，备用；
[0033] 将四敲基因酵母kanMX抗性标签上游同源序列、DR-K1URA3-DR营养标签、CYC1终 止子、Btcrtl、GAL10启动子、GAL1启动子、PacrtB、PGK1终止子以及kanMX抗性标签下 游同源序列顺次拼接，获得基因片段2 (基因片段模式图见图2)，即kanMX抗性标签上游同 源序列-DR-K1URAS-DR-lCTa-crtl-Pud-P^^-crtB-Tj^-kanMX抗性标签下游同源序列，备 用；
[0034] 将酵母leu2位点上游同源序列、LEU2标记、TDH2终止子、ACT1终止子、截短的 HMG-CoA还原酶基因tHMGRl、GAL10启动子、GAL1启动子、TmcrtE、GPMl终止子、酵母leu2 位点下游同源序列顺次拼接，获得基因片段3(基因片段模式图见图3)，S卩leu2位点上游同 源序列-LElK-TTDi^-TACTftHMGRl-PGAUd-PGAu-crtE-TGpm-leu〗位点下游同源序列，备用；
[0035] 将基因片段3中TDH2终止子及其上游同源序列、DR-K1URA3-DR营养标签、 CYC1终止子、Btcrtl、GAL3启动子、基因片段3中ACT1终止子及其下游同源序列顺次拼 接，获得基因片段4(基因片段模式图见图4)，即TDH2终止子及其上游同源序列-DR-K1 URA3-DR-TeTC1-BtCrtl-PMU-TACT1-ACT1终止子及其下游同源序列，备用；
[0036] 将酵母内源FPP合酶基因ERG20和GGPP合酶基因BTS1进行连接，获得融合基因 BTS1-ERG20,然后将酵母his3位点上游同源序列、HIS3标记、EN02终止子、ACT1终止子、截 短的HMG-CoA还原酶基因tHMGRl、GAL10启动子、GAL1启动子、融合基因BTS1-ERG20、FBA1 终止子、酵母his3位点下游同源序列顺次拼接，获得基因片段5 (基因片段模式图见图5)， 即his3 位点上游同源序列-HIS3-TENQ2-TAcn-tHMGRl-PGAL1〇-PGAL1- (BTS1-ERG20) -TFBA1-his3 位 点下游同源序列，备用；
[0037] 将酵母YGLCtau3位点上游同源序列、hphA抗性标签、IDI1终止子、基因IDI1、 GAL7启动子、TOC1终止子、SaPMK、GAL10启动子、GAL1启动子、SaMK、HXI7终止子、酵 母YGLCtau3位点下游同源序列顺次拼接，获得基因片段6(基因片段模式图见图6)，即 YGLCtau3 上游同源序列-hphA-T皿rlDIl-P^^-TpDa-PMK-P^^-PGAu-MK-THm-YGLCtauS下游 同源序，备用；
[0038]将酵母gal7基因下游同源序列、nat抗性标签、ERG13终止子、基因ERG13、GAL7启 动子、ERG19终止子、基因ERG19、GAL10启动子、GAL1启动子、基因ERG10及其终止子、酵母 gall基因下游同源序列顺次拼接，获得基因片段7 (基因片段模式图见图7)，即gal7下游 同源序列-nat-TEKG13-ERG13-PGAL7-TEKG19-ERG19-PGAL1(l-PGAL1-ERG10-TE謂-gall下游同源序列， 备用；
[0039] 将酵母YMRWdeltal5位点上游同源序列、GAL1启动子上游激活序列UAS、GAL1 启动子、成团泛菌来源或杜氏盐藻来源或雨生红球藻来源的crtY基因、ADH1终止子、 DR-K1URA3-DR营养标签、YMRWdeltal5位点下游同源序列顺次拼接，获得基因片段8 (基 因片段模式图见图8)，即YMRWdeltal5位点上游同源序列-UAS-Pn-crtY-T^m-DR-Kl URA3-DR-YMRWdeltal5位点下游同源序列，备用；
[0040] 将酵母YNRCde1ta9位点上游同源序列、GAL1启动子上游激活序列UAS、GAL1 启动子、成团泛菌来源或杜氏盐藻来源或雨生红球藻来源的crtY基因、ADH1终止子、 DR-K1URA3-DR营养标签、YNRCdelta9位点下游同源序列顺次拼接，获得基因片段9(基 因片段模式图见图9)，即YNRCdelta9位点上游同源序列-UAS-P^-crtY-I^-DR-Kl URA3-DR-YNRCde1ta9位点下游同源序列，备用；
[0041] 步骤2、将基因片段1通过醋酸锂法转入所述四敲基因酵母中，通过基因片段1中 trpl位点上、下游同源序列与四敲基因酵母基因组上trpl位点发生重组而整合到基因组 上；
[0042] 步骤3、将基因片段3通过醋酸锂法转入所述四敲基因酵母中，通过基因片段3中 leu2位点上、下游同源序列与四敲基因酵母基因组上leu2位点发生重组而整合到基因组 上；
[0043] 然后将基因片段4继续通过醋酸锂法转化到已转入基因片段3的四敲基因酵母 中，通过基因片段4中TDH2终止子及其上游同源序列、ACT1终止子及其下游同