，发现富集液中2, 4 -D被完全降解。将获得的有效果 的富集液进行梯度稀释，涂布于含有l〇〇mg? 1:2,4 -D的固体无机盐平板培养基，30°C倒 置培养5d，挑取单菌落于3ml液体LB试管培养基中，然后保存并验证单菌的2, 4 -D降解功 能，从而获得2, 4-D降解菌株LZ35。2015年04月15日保藏于中国典型培养物保藏中心， 菌种保藏号为CCTCCNO:M2015235。经鉴定LZ35属无色杆菌属（Achromobactersp.)主 要生物学特性为(T，菌体为杆状，大小约0. 4 - 0. 7ym宽，1. 4 - 2. 8ym长，好氧；过氧化氢 酶、氧化酶和V.P.反应为阳性；B引哚反应阴性；不能水解淀粉，能氧化葡萄糖产酸，使石蕊 牛乳酸凝固，能抗氨苄青霉素、卡那霉素、庆大霉素、链霉素、氯霉素、四环素、壮观霉素和红 霉素，该菌株16SrRNA基因的GenBank登陆号为KP996670。
[0033] 菌株LZ35在以2, 4 -D，二甲四氯为唯一碳源的无机盐培养基中对目标除草剂 的降解：将本发明的2, 4 -D除草剂降解菌株LZ35的原种在培养皿上活化，并测定降解 性能，接种于试管斜面上，挑取菌株LZ35单菌，接种于100ml液体LB培养基中，30°C摇床 150rpm?min-1培养过夜。然后离心收集菌体，用无菌水洗绦菌体两次后，再用无菌水重悬 菌体。然后将菌体分别转接于加有终浓度为lOOppm的2, 4 -D和二甲四氯的液体无机盐培 养基中，并同时设置空白对照。30°C摇床150rpm?mirT1培养两天后直接吸取培养基离心 后用高效液相色谱检测无机盐培养基中2, 4 -D及二甲四氯的含量。通过计算峰面积，得出 了菌株LZ35在以2, 4 -D和二甲四氯为唯一碳源的无机盐培养基中对目标除草剂的降解率 均高达99%。即菌株能完全矿化2, 4 -D和二甲四氯。
[0034] 菌株LZ35降解效果检测方法：
[0035] 紫外扫描法：
[0036] 由于2, 4 -D具有很高的水溶性，所以将经过降解处理的无机盐液体培养液，以新 鲜配制的无机盐培养液扫描基线，直接在UV- 2450PC型分光光度计上于200~350nm段进 行紫外扫描。液相色谱法：
[0037] 由于2, 4 -D具有很高的水溶性，所以直接取1ml经过降解处理的无机盐液体培 养液，12, 000Xg离心lOmin，收集上清液。然后用0. 22微米的水相滤膜过滤。液相色谱 条件：岛津RID- 10A;C18反相柱；流动相：甲醇：水：乙酸（体积比80/19. 5/0. 5)，流速： lml?min- \紫外检测器，波长225nm和235nm;进样量：20y1 〇
[0038] 菌株LZ35在实验室条件下降解2, 4 -D效果的紫外和HPLC检测图（图7, 8)。
[0039] 实施例2
[0040] 将本发明的2, 4-D除草剂降解菌株LZ35的原种在培养皿上活化，并测定降解性 能，接种于试管斜面上备用。试管种接种于含200ml肉汤培养基（牛肉膏3克，蛋白胨10 克，NaCl5克，水1000毫升，pH7. 0-7. 2)的1000ml摇瓶中，恒温振荡培养至对数期，准 备接种种子罐。种子罐500升，投料量400升，培养基配方为：葡萄糖0.8%，（NH4)2S041 %， K2HP040. 2 %，MgS040. 05%，NaCl0? 01 %，CaC030 . 3 %，酵母膏 0? 02%，pH值 7. 2-7. 5 〇 投料 完毕后121°C高压湿热灭菌，冷却至33°C后，将上述培养好的摇瓶菌种按10%的接种量接 种入500升种子罐，培养至对数生长期，搅拌速度为220转/分，无菌空气通入量为1 :0. 8。 将到达对数期的种子液按10%的接种量接入生产罐培养，生产罐所用培养基成分与种子罐 培养基相同。生产罐容量5吨，投料量4. 5吨。投料后的生产罐1.lkg/cm2的压力下，121°C 高压湿热灭菌，灭菌后冷却至35°C以下，通无菌空气保持无菌状态备用。接种后的生产罐 温度控制在30 - 35°C，生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1 :0. 6 - 1. 2,搅拌速度 为240转/分，整个工艺流程培养时间为36 - 48小时。发酵结束后菌体数量达到10亿个 /ml以上。发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型或采用泥炭 吸附用包装袋分装成固体菌剂剂型。
[0041] 实施例3
[0042] 将本发明的2, 4 -D除草剂降解菌株LZ35的原种在培养皿上活化，并测定降解性 能，接种于试管斜面上备用。试管种接种于含500ml肉汤培养基（牛肉膏3克，蛋白胨10 克，NaC15克，水1000毫升，pH7. 0 -7. 2)的1000ml摇瓶中，恒温振荡培养至对数期。离心 收集菌体，无菌水重悬菌体。然后取新鲜供试土壤，加入2, 4 -D水溶液，充分拌匀，使土壤 中2, 4 -D的浓度分别为50mg?kg-1和lOOmg?kg-1干土。同时，处理组接种新鲜的LZ35 菌株菌悬液于土壤中，空白对照组加入无菌水，同样搅拌均匀。将拌好的土壤分装入的一次 性塑料杯中，用清水调节土壤含水量约为20%。将塑料杯放置在模拟自然环境的20°C恒 温光照培养箱内，白天保持光照度40,白天时间为12h?d1。挑选催芽后大小一致、发育良 好的玉米种子，种入约lcm深的土层中，每杯种5粒，每组设置三个重复，每天采用称重法补 水以保持土壤含水量。十天左右后，从恒温光照培养箱中取出，观察比较玉米植株的生长情 况，并测量玉米植株的根长，茎长和植株净重等指标，结果见表1及图1~6。
[0043]表1 :菌株LZ35对玉米2,4-D残留药害的解除作用比较
【主权项】
1. 一株除草剂2, 4-D降解菌株LZ35,其特征在于2015年4月15日保藏于中国典型培 养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC NO :M 2015235。2. 权利要求1所述的除草剂2, 4-D降解菌株LZ35在降解除草剂2, 4-D中的应用。3. 权利要求1所述的除草剂2, 4-D降解菌株LZ35在制备降解除草剂2, 4-D的菌剂中 的应用。4. 一种用权利要求1所述的除草剂2, 4-D残留降解菌株LZ35生产的降解菌剂。5. 根据权利要求4所述的降解菌剂，其特征在于所述的降解菌剂是通过以下方法生产 而成： 1) 将权利要求1所述的除草剂2, 4-D降解菌株LZ35试管种接种于肉汤培养基摇瓶中， 振荡培养至对数期； 2) 将上述培养好的菌种按10 %的接种量接种入种子罐，培养至对数生长期，种子罐 所用的培养基配方为：葡萄糖 0.8%，（NH4)2SO4 1%，K2HPO4 0.2%，MgSO4 0.05%，NaCl 0? 01%，CaCO3 0? 3%，酵母膏 0? 02%，pH 值 7. 2-7. 5 ; 3) 将种子液按10%的接种量接入生产罐培养，生产罐所用培养基与种子罐培养基相 同； 4) 发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体制剂或采用泥炭吸 附用包装袋分装成固体菌剂制剂； 其中，在种子罐和生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1 :〇. 6 - 1. 2,搅拌速度为 180 - 240转/分，培养温度为30 - 35°C，全流程培养时间为36 - 48小时，发酵结束后 菌体数量达到10亿个/ml以上。6. 权利要求5所述的菌剂在降解除草剂2, 4-D中的应用。7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于权利要求5所述的菌剂在降解土壤中残留 的除草剂2, 4-D中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种除草剂2,4‐D的降解菌株及其生产的菌剂和应用，2015年4月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC NO:M2015235。该菌株为革兰氏染色反应阴性菌株LZ35，经鉴定为无色杆菌属(Achromobacter sp.)。本发明所述的2,4‐D降解菌株LZ35可应用于除草剂2,4‐D的降解。一种用本发明所述的2,4‐D降解菌株LZ35生产的降解菌剂，2天内降解99％的液体培养基中的100mg/l的2,4‐D，直接施用可显著降低作物药害，解决了农业生产中除草剂残留超标问题，生产出无毒无公害的绿色农产品。CCTCC NO：M201523520150415
【IPC分类】B09C1/10, A62D3/02, C12R1/025, C12N1/20, A62D101/04
【公开号】CN104962491
【申请号】CN201510321103
【发明人】蒋建东, 张龙, 杜方岭, 周庆新, 王军华, 陈凯, 李顺鹏
【申请人】南京农业大学
【公开日】2015年10月7日
【申请日】2015年6月11日