一种麝鼠香腺分泌细胞体外分离培养的方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种麝鼠香腺分泌细胞体外分离培养的方法及应用，属于细胞生物学
技术领域。
【背景技术】
[0002] 麝鼠分泌的麝香也叫麝鼠香，其中含有与天然麝香相同的麝香酮、降麝香酮、烷酮 等主要成分，可广泛应用于传统的中药和香料领域。麝鼠香是由香腺分泌细胞所分泌的，因 此体外分离培养麝鼠香腺分泌细胞既可为研宄香腺的分泌机理提供试验材料，又可为体外 生产麝鼠香的应用提供理论依据。
[0003]目前关于体外分离培养麝鼠香腺分泌细胞的技术，多是采用相关蛋白酶消化后混 合培养的方法。这种方法使培养体系中即含有分泌细胞又含有支持细胞，又因为支持细胞 的分裂速度远远大于分泌细胞，细胞经过几次传代后，培养系统中所剩分泌细胞寥寥无几， 给分泌细胞的纯化及培养带来很大的困扰。因此蛋白酶消化后混合培养的方法得到的分泌 细胞产量及质量都不高，并极大的耗费了时间、财力以及人力。
【发明内容】
[0004] 为解决目前麝鼠香腺分泌细胞分离纯化培养的不足，本发明提供了一种麝鼠香腺 分泌细胞体外分离培养的方法及应用，采用的技术方案如下：
[0005] 本发明的目的在于提供一种麝鼠香腺分泌细胞体外分离培养的方法，该方法是采 取的处于泌香期的麝鼠的香腺组织，立即置于4°C预冷的含有青霉素和链霉素的磷酸盐缓 冲溶液中进行清洗处理，清除香腺的外围组织，切割处理后的香腺组织并利用4°C预冷的含 有青霉素和链霉素的磷酸盐缓冲溶液进行清洗后离心分离，再利用二型胶原酶进行消化处 理，消化后离心分离，培养分离得到的沉淀组织。
[0006] 所述方法的步骤如下：
[0007] 1)采取处于泌香期的雄性麝鼠的香腺组织并立即将所得的香腺组织于4°C预冷 的含有青霉素和链霉素的磷酸盐缓冲溶液中进行清洗处理，洗去表面残留的香腺液，清洗 完将所得香腺浸泡于4°C预冷的含有青霉素和链霉素的磷酸盐缓冲溶液中；
[0008] 2)去除步骤1)所得香腺组织中得到外围组织，并将组织移入含有4°C预冷的含有 青霉素和链霉素的磷酸盐缓冲溶液的培养皿中；
[0009] 3)利用动物组织切割器将切割步骤2)的香腺，并利用4°C预冷的含有青霉素和链 霉素的磷酸盐缓冲溶液进行清洗，离心分离清洗后的香腺组织，弃去上清液；
[0010] 4)利用二型胶原酶对步骤3)离心得到的香腺组织进行消化处理，处理后离心并 弃去上清液；
[0011] 5)利用DMEM/F-12培养液培养步骤4)分离得到的香腺组织沉淀。
[0012] 优选地，所述4°C预冷的含有青霉素和链霉素的磷酸盐缓冲溶液，青霉素和链霉素 的浓度为500U/mL。
[0013]优选地，步骤2)所述外围组织，是香腺周围残留的脂肪、血管、结缔组织及薄膜。 [0014] 优选地，步骤3)所述利用动物组织切割器切割，是将所得香腺组织切割为厚度为 0. 7cm的组织碎片。
[0015] 优选地，所述离心分离，是在lOOOrpm的条件下离心5min。
[0016] 优选地，步骤4)所述利用二型胶原酶进行消化处理，是使用离心所得香腺组织体 积4-6倍的150U的二型胶原酶进行消化处理。
[0017] 优选地，步骤5)所述利用DMEM/F-12培养液培养，是先在37°C、5%C02、饱和湿度 的条件下倒置培养4h，再加入胎牛血清继续培养，第二天吸取并弃去胎牛血清后，加入新鲜 DMEM/F-12培养液，在37°C、5%C02、饱和湿度的条件下继续培养，再换液培养直至分泌细胞 汇集成片。
[0018] 所述方法的具体步骤如下：
[0019] 1)在无菌条件下采取处于泌香期的雄性麝鼠的香腺组织，并迅速将所得的香腺组 织置于4°C预冷的含有青霉素和链霉素的磷酸盐缓冲溶液中清洗3-5次，洗去表面残留的 香腺液，清洗完再将所得香腺浸泡于l〇ml，4°C预冷的含有青霉素和链霉素的磷酸盐缓冲溶 液中；
[0020] 2)去除步骤1)所得香腺组织周围的残留的脂肪、血管、结缔组织及薄膜，再将组 织移入到经过4°C预冷的10ml含有青霉素和链霉素的磷酸盐缓冲溶液的培养皿中；
[0021] 3)利用动物组织切割器将切割步骤2)的香腺切割为厚0. 7cm的香腺组织碎片， 并利用l〇ml4°C预冷的含有青霉素和链霉素的磷酸盐缓冲溶液进行清洗，去除残留香腺液 后，再lOOOrpm条件下离心5min，弃去上清液；
[0022] 4)利用步骤3)所得香腺组织碎片总体积5倍的150U的二型胶原酶进行消化处 理，处理结束后再于lOOOrpm条件下离心5min，弃去上清液；
[0023] 5)向步骤4)所得的消化香腺组织碎片中加入2ml新鲜DMEM/F-12培养液，吹打 均匀后于37°C、5%C02、饱和湿度的条件下倒置培养4h，培养结束后再加入500y1胎牛血 清，在于37°C、5%C02、饱和湿度的条件下正置培养过夜，培养结束后将吸走胎牛血清后，加 入lml新鲜的DMEM/F-12培养液，再于37°C、5%C02、饱和湿度的条件下48h，培养结束后加 入5ml新鲜DMEM/F-12培养液，在37°C、5%C02、饱和湿度的条件下继续培养，重复更换培 养液直至香腺细胞从香腺组织碎片的周围长出并汇集成片。
[0024] 所述任一方法用于获取麝鼠香腺分泌细胞。
[0025] 本发明有益效果：
[0026] 1.麝鼠香腺分泌细胞体外分离培养的现有培养技术多为蛋白酶消化法，步骤繁 琐，费时费力。本发明简化了麝鼠香腺分泌细胞的体外分离培养步骤，只需得到均匀的小块 香腺组织，直接就可以进行培养操作，而且还能够保证细胞的生长条件接近于体内微环境。
[0027] 2.麝鼠香腺组织经二型胶原蛋白酶短时消化后，可使组织块周围的结缔组织离 散，暴露出香腺组织的分泌单元，从而使分泌单元的主要成分-分泌细胞从分泌单元周围 爬出，并在本专利培养条件下快速成片生长。在此条件下的细胞大部分都是分泌细胞，可简 单快速的得到纯度较高的分泌细胞，极大的缩短了分泌细胞分离纯化的过程。
【附图说明】
[0028] 图1为实施例1香腺组织块及其周围生长的分泌细胞。
[0029] 图2为实施例3香腺分泌细胞及其周围的支持细胞。
【具体实施方式】
[0030] 下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
[0031] 以下实施例所使用的材料、试剂、方法和仪器，未经特殊声明，均为本领域常规的 材料、试剂、方法和仪器，本领域技术人员均可通过商业渠道获得。
[0032] 本发明所用的动物组织切割器械是根据专利号为ZL201420335401. 8的专利制作 获得的。实施例1
[0033] 1)将试验用6月龄处于泌香期的麝鼠中香腺组织于无菌环境中取出，并迅速置于 4°C预冷的500U/ml青、链霉素PBS中，冲洗5次后备用；
[0034] 2)去除香腺组织周围残留的脂肪、血管及结缔组织，剥去香腺组织外围的薄膜，用 动物组织切割器械将香腺组织切成厚度为0. 7cm的均匀小块组织；
[0035] 3)使用4°C预冷的500U/ml青、链霉素PBS清洗厚度为0. 7cm的均匀小块香腺组 织，清洗8次后，观察上清液由浑浊变为澄清，1000rpm/min离心5min，弃上清；
[0036] 4)向装有小块香腺组织的15ml的离心管中加入5ml的150U的二型胶原蛋白酶， 吹打均勾后，迅速置于离心机中l〇〇〇rpm/min离心5min，弃上清；
[0037] 5)加入2ml新鲜DMEM/F-12培养液，吹打均匀后，使用移液管将组织均匀的铺在 规格为25cm2的细胞培养瓶中，将培养瓶倒置后弃去残余培养液，于37°C、5%C02、饱和湿度 的条件下倒置培养4h;
[0038] 6)4h后，向铺有小块香腺组织的细胞培养瓶中加入500y1的胎牛血清，于37°C、 5%C02、饱和湿度的条件下正置过夜培养香腺组织块；
[0039] 7)培养17h后，将细胞培养瓶中500y1的胎牛血清吸走，加入1ml新鲜DMEM/F-12 培养液，于37°C、5%C02