干细胞用于减少白细胞外渗的用图
【专利说明】
[0001] 本申请为分案申请，其原申请的申请日为2010年7月21日，申请号为 201080041878.X，名称为"干细胞用于减少白细胞外渗的用途"。
技术领域
[0002] 本发明总得来说涉及借助分泌可减少白细胞外渗的因子的细胞减少炎症的方法。 具体地，本发明涉及使用分泌因子的细胞的方法，所述因子可下调细胞粘附分子在血管内 皮细胞中的表达。下调细胞粘附分子的表达可减少白细胞黏着内皮细胞，从而减少外渗。结 果是减少了炎症。因此，本发明提供用于治疗与不想要的炎症组分相关的病理学疾病（包 括心血管疾病）的方法。本发明还涉及筛选调节细胞下调内皮细胞中细胞粘附分子表达的 能力的试剂的药物发现方法。本发明还涉及细胞库，其可被用于提供用于给予受试者的细 胞，所述库包含在下调内皮细胞中的细胞粘附分子的表达和减少白细胞黏附和外渗方面具 有所需能力的细胞。本发明还涉及包含具有特定所需能力的细胞的组合物。本发明还涉及 在给予所述细胞之前进行的诊断方法，包括评估待给予的细胞的所需能力的测定。本发明 还涉及治疗后诊断测定以评估所述细胞对被治疗的受试者的作用。本发明还涉及药物组合 物中具有需要能力的细胞。所述细胞是具有多能特性的非胚胎非生殖细胞。所述多能特性 可包括多能标记物的表达和广泛分化潜能。
【背景技术】
[0003]
[0004] 急性炎症的过程由受伤组织局部的血管起始，所述血管改变以允许血浆蛋白质和 白细胞渗入周围组织中。进入所述组织的流体流增加可导致与炎症相关的特征性肿胀。血 管经受显著血管变化，包括血管舒张、渗透性增大和血流变缓，其由各种炎症介体的作用诱 导。增加的血管渗透性可导致血浆进入所述组织，引起由于血液中的细胞浓度增加而产生 的淤滞。淤滞使得白细胞沿着内皮边缘化，这是它们募集进入所述组织的关键步骤。正常 血流可以防止上述过程的发生，因为沿着血管周边的剪切力将细胞移动到血管中部。因此， 所述变化使得白细胞通过构成血管的内皮和基底膜外渗。一旦进入所述组织，所述细胞就 沿着趋化梯度移动到达损伤部位，在这里它们能够尝试除去刺激物并且修复所述组织。
[0005] 白细胞从血液通过血管移动至组织被称为外渗，并且可被分为多个大步骤：
[0006] (1)白细胞局部化并且募集至炎症局部的内皮一一包括边缘化和黏附至内皮细 胞：白细胞的募集是受体介导的。炎症的产物，例如组胺，可促进P-选择蛋白在内皮细胞上 立即表达。该受体微弱地结合至白细胞表面的碳水化合物配体，使得它们随着键的形成和 断裂沿着内皮表面"滚动"。来自受损细胞的细胞因子可诱导E-选择蛋白在内皮细胞上表 达，其与P-选择蛋白的功能类似。细胞因子也可诱导整联蛋白配体在内皮细胞上表达，这 进一步使得白细胞慢下来。这些微弱结合的白细胞如果没有被受损组织产生的趋化因子激 活就能自由分离。活化可增加结合的整联蛋白受体对内皮细胞表面的配体的亲和性，将白 细胞牢固地结合至内皮。
[0007] (2)通过血细胞渗出过程穿内皮的迀移，被称作变移：趋化因子梯度可刺激附着 的白细胞在内皮细胞之间移动并且穿过基底膜进入组织。
[0008] (3)白细胞通过趋化作用在组织中移动：达到组织间质的白细胞通过表达的整联 蛋白和CD44结合至细胞外基质蛋白质以防止它们从位点上脱落。趋化物使得白细胞沿着 趋化梯度朝向炎症源移动。
[0009]白细胞外渗是白细胞从循环系统移出，朝向组织损伤或感染的部位的移动。该过 程形成先天免疫应答的一部分，包括募集非特异性白细胞。单核细胞还可在不存在感染和 组织损伤的情况下，在它们发育为巨噬细胞的过程中使用该过程。
[0010] 白细胞外渗主要出现在毛细血管后微静脉，其中血流动力学剪切力被最小化。可 将该过程理解为多个步骤，下文概括为"趋化作用""滚动黏着""紧密黏附"和"（内皮）变 移"。已经证明每当这些步骤中的任一步骤被抑制时，白细胞募集即停止。
[0011] 趋化作用
[0012] 识别病原体并被病原体活化后，感染组织中的定居巨噬细胞释放细胞因子，例如 IL-l、TNF-a和趋化因子。IL-1和TNF-a可引起感染部位附近的血管内皮细胞表达细胞 粘附分子，包括选择蛋白。循环白细胞由于趋化因子的存在而朝向损伤或感染部位集中。
[0013] 滚动黏着
[0014] 像尼龙搭链一样，循环白细胞上的碳水化合物配体通过边缘亲和力与血管内壁的 选择蛋白分子结合。这使得白细胞慢下来并且开始沿着血管壁内表面滚动。在这种滚动中， 在选择蛋白和它们的配体之间发生短暂的键形成和断裂。
[0015] 紧密黏着
[0016] 同时，由巨噬细胞释放的趋化因子可激活滚动的白细胞并且使得表面整联蛋白分 子从默认的低亲和力状态转换为高亲和性状态。这是通过整联蛋白的近分泌活化促进的， 其中所述整联蛋白的近分泌活化通过内皮细胞释放的趋化因子和可溶因子实现。整联蛋白 在活化状态与内皮细胞上表达的互补受体以高亲和性紧密结合。这使得白细胞固定不动， 尽管有流动的血流的剪切力。
[0017] 夺務
[0018] 白细胞的细胞骨架以如下方式重组，即白细胞铺展在内皮细胞上。白细胞以这种 形式伸出伪足并且通过内皮细胞间的空隙。白细胞变移随着出现在白细胞和内皮细胞表面 上的PECAM蛋白与所述细胞相互作用并且有效地将所述细胞拉动通过内皮而出现。白细胞 可分泌降解基底膜的蛋白酶，使得它们能够逸出血管一一该过程被称为血细胞渗出。一旦 白细胞处于间隙液中，即沿着趋化梯度朝向损伤或感染的部位移动。
[0019] 嗜中性粒细胞在炎症部位积聚是由特定类的细胞粘附分子介导的，所述细胞粘附 分子包括白细胞上的CD18整联蛋白和选择蛋白（内皮上的P-和E-选择蛋白，以及白细胞 上的L-选择蛋白）。这一点得到了对患有白细胞黏附缺陷综合征患者进行的研宄的支持， 所述患者的白细胞在CD18或选择蛋白碳水化合物配体表达方面有遗传缺陷（例如，II型 白细胞黏附缺陷）。
[0020] 诜择蛋白
[0021] 选择蛋白在内皮细胞（通过组织巨噬细胞）的细胞因子活化后很快表达。活化的 内皮细胞最初表达P-选择蛋白分子，但是到活化后2小时内，倾向于表达E-选择蛋白。内 皮选择蛋白与白细胞跨膜糖蛋白（包括唾液酸化路易斯血型抗原X)上的碳水化合物结合。
[0022] P-诜择蛋白:P-选择蛋白在活化的内皮细胞和血小板上表达。P-选择蛋白的合成 可由凝血酶、白细胞三烯B4、补体片段C5a、组胺、TNF-a或LPS诱导。这些细胞因子诱导 内皮细胞中的怀布尔-帕拉德体的外化，将预先形成的P-选择蛋白呈递于内皮细胞表面。 P-选择蛋白可作为配体结合PSGL-1。
[0023] E-选择蛋白：内皮白细胞黏附因子-1由细胞因子刺激的内皮细胞表达。认为它 通过介导细胞黏附至血管内壁而负责血液白细胞在炎症部位积聚。它表现出与LUAM1的 结构特征一致的结构特征，包括存在凝集素-或EGF-样结构域，之后有含6个保守半胱 氨酸残基的短共有重复序列（SCR)结构域。这些蛋白质是细胞粘附分子的选择蛋白家族 的一部分（'^七8〇116七&1.，-了.￡叉？.]^(1.172:263-272(1990) ;(：〇111118 6七&1.，_了.81〇1. Chem. 266:2466-2473 (1991))。在P-选择蛋白合成后不久E-选择蛋白合成，其由例如IL-1 和TNF-a的细胞因子诱导。E-选择蛋白可结合PSGL-1和ESL-1。
[0024] L-诜择蛋白:L-诜择蛋白在一心白细朐h组成塑表汰，并目P,知其作为配体与 GIyCAM-l、MadCAM-l和CD34 结合。
[0025] -些选择蛋白的表达抑制可导致免疫应答减缓。如果L-选择蛋白没有产生，免疫 应答可能会慢10倍，因为P-选择蛋白（其也可由白细胞产生）相互结合。P-选择蛋白可 以以高亲和性相互结合，但是其出现的频率较低，因为受体位点密度比更小的E-选择蛋白 分子低。这可增加初始的白细胞滚动速度，延长缓慢的滚动阶段。
[0026] 整联蛋白
[0027] 参与细胞黏附的整联蛋白主要在白细胞上表达。滚动的白细胞上的0 2整联蛋白 与内皮细胞黏附因子结合，阻止细胞运动。
[0028] LFA-见于循环白细胞，可与内皮细胞上的ICAM-1和ICAM-2结合。
[0029] Mac-1见于循环白细胞，可与内皮细胞上的ICAM-1结合。
[0030] VLA-4见于白细胞和内皮细胞，可促进趋化作用；它还可与VCAM-1结合。
[0031] 通过细胞外趋化因子的细胞活化可导致预先形成的0 2整联蛋白从细胞库中释 放出来。整联蛋白分子迀移至细胞表面并且以高亲合力斑块的形式聚集。细胞内整联蛋白 结构域通过胞质因子介导与白细胞细胞骨架联结，所述胞质因子例如胞踝蛋白、a-辅肌动 蛋白和黏着斑蛋白。这种联结引起整联蛋白四级结构的构象变化，使得配体可以接近结合 位点。二价阳离子（例如，Mg2+)也是整联蛋白-配体结合需要的。
[0032] 整联蛋白配体ICAM-1和VCAM-1由炎症细胞因子活化，而ICAM-2由一些内皮细胞 组成型表达，但是会被炎症细胞因子下调。ICAM-1和ICAM-2共有两个同源N-末端结构域； 两者可都与LFA-1结合。
[0033] 在趋化作用期间，M整联蛋白与细胞外基质组分结合促进细胞运动：VLA-3、 VLA-4和VLA-5与纤连蛋白结合，VLA-2和VLA-3与胶原蛋白和其他细胞外基质组分结合。
[0034] 细朐闵子
[0035] 外渗受到由炎症应答产生的背景细胞因子环境的调节，并且与具体的细胞抗原无 关。最初免疫应答释放的细胞因子诱导血管舒张并且降低沿血管表面的电荷。血流被减缓， 促进分子间结合。
[0036] ILzl活化定居淋巴细胞和血管内皮。
[0037] TNF-a增加血管滲诱件并目.活化血管内皮。
[0038] CXCL8(IL-8)形成趋化梯度，其引导白细胞朝向组织损伤/感染部位移动（CCL2具 有与CXCL8类似的功能，包括单核细胞外渗和发育为巨噬细胞）；还活化白细胞整联蛋白。
[0039] 可以得到总结炎症中的外渗过程的综述文章。参见Steeber,D.and Tedder,T. ,ImmunologicResearch,22/2-3:299-317 (2000)；Steeberetal. ,FSAEB J, 9:866-873(1995);和Wagner,D.andFrenette,P. ,Blood, 111:5271-5281 (2008)〇 [0040] 堅(3-岩藻糖基-N-乙酰基-乳糖胺）是一组分化抗原一一一种免疫学上重要 的分子。CD15是能够在糖蛋白、糖脂和蛋白聚糖上表达的碳水化合物黏着分子（不是蛋白 质）。
[0041] ⑶15可介导吞噬作用和趋化作用，见于嗜中性粒细胞上；在患有何杰金病、B细胞 慢性淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病和大部分非淋巴细胞性白血病的患者中 表达。它还被称为路易斯x和SSEA-1 (阶段特异胚胎抗原1)并且代表鼠多能干细胞的一 种标记物，其中它在植入前胚胎中的细胞的黏附和迀移中起重要作用。它由_(岩藻糖 基转移酶4)和FUT9合成。
[0042] CD15s
[0043] 对于E-选择蛋白和P-选择蛋白介导的白细胞黏附，唾液酸化路易斯血型抗 原X寡糖决定子是白细胞反受体的必要组分。该低聚糖分子分布在粒细胞、单核细胞和 天然杀伤细胞的表面。在最终使得白细胞离开血管树（vasculartree)并且被募集至 淋巴组织和炎症部位的过程中，白细胞黏附至这些选择蛋白的形成在是早期的且重要的 步骤。Natsuka等人，J.Biol.Chem. 269:16789-16794(1994)和Sasaki等人，J.Biol. Chem. 269:14730-14737(1994)分离了编码人白细胞a-1，3-岩藻糖基转移酶--FUI7,其 能够合成唾液酸化路易斯血型抗原x决定子--的cDNA。
[0044] Natsuka等人发现，当FUI7在哺乳动物细胞中表达时，所述cDNA指导细胞表面 唾液酸化路易斯血型抗原x部分的合成，而不是路易斯X、路易斯A、唾液酸化路易斯a或 VIM-2决定子的合成。Sasaki等人证明了在体内FUI7合成与E-选择蛋白结合的唾液酸化 路易斯x部分的能力，并且报道了FUI7在白细胞中受限的表达。
[0045] Chen等人，Proc.Nat.Acad.Sci. 103:16894-16899(2006)指出，活化的T细胞，尤 其是Thl细胞表达唾液酸化路易斯X，但是其他T细胞不表达。使用报告基因分析，他们表 明了TBET促进了FUI7的转录，而GATA3抑制了FUI7的转录。TBET干扰GATA3与其靶DNA 的结合，但是GATA3还干扰TBET与FUI7启动子的结合。GATA3通过以磷酸化依赖方式募集 组蛋白脱酰酶-3和HDAC5,并且通过在与TBET的N端结合中与CBP/p300竞争，调节FUI7 的转录。通过R0G介导的GATA3抑制获得了FUI7和唾液酸化路易斯x在T细胞中的最大 表达。Chen等人（2006)得出以下结论:GATA3/TBET转录因子复合体可调节淋巴细胞归巢 受体的细胞系特异表达；糖缀合物受到该复合体调节以在Thl和Th2淋巴细胞亚群中实现 细胞系特异性表达。
[0046] 选择蛋白P配体或P-选择蛋白糖蛋白配体（PSGL1)是髓细胞和受激的T淋巴细 胞上的P-选择蛋白的高亲和性反受体。因此，它在将这些细胞束缚至活化的血小板或表达 P-选择蛋白的内皮中起到关键作用。
[0047] 基于流式细胞术、免疫印迹和流动室分析（flowchamberanalyse)，Fuhlbrigge 等人，Nature389:978-981(1997)提出由岩藻糖基转移酶-7介导的不同的PSGL1翻译后修 饰可调节皮肤淋巴细胞相关抗原（CLA)的表达，所述抗原在T细胞中可结合P-选择蛋白和 E-选择蛋白。CLA-阳性T细胞是皮肤归巢记忆T细胞，其由它们与单克隆抗体HECA-452 的反应性界定。CLA-阳性T细胞在很多炎性皮肤疾病（包括银肩病）中浸润皮肤受损处。
【发明内容】
[0048] 本发明总得来说涉及用于减少炎症的方法。
[0049] 本发明更具体地涉及减少白细胞（嗜中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞）外渗的 方法。
[0050] 本发明更具体地涉及减少白细胞从循环系统渗入周围组织的方法。
[0051] 本发明还涉及减少白细胞黏附至血管的方法。
[0052] 本发明还涉及减少白细胞黏附至血管内皮的方法。
[0053] 本发明还涉及减少白细胞黏附至血管壁中的内皮细胞的方法。
[0054] 本发明还涉及用于下调内皮细胞中的黏着分子的表达的方法。
[0055] 本发明还涉及减少内皮细胞活化的方法。
[0056] 本发明还涉及减少血管内皮中的内皮细胞活化的方法。.
[0057] 内皮细胞活化可由暴露于炎症细胞因子造成。细胞因子包括但不限于肿瘤坏死因 子-a(TNF-a)、白细胞介素-1 (IL-1)、双调蛋白、LPS和其他Toll样受体配体（致病性肽， 例如fMLP;来自损伤组织的肽，例如纤连蛋白片段）、凝血酶、组胺、氧自由基和IFN-Y。在 本发明的上下文中，活化包括血管内皮细胞中细胞粘附分子的上调。
[0058] 本发明还涉及降低血管壁中的内皮细胞与白细胞上的黏着配体或部分结合的能 力的方法。所述黏着配体或部分包括但不限于PSGL-1、ESL-1、⑶15s、a4-整联蛋白、⑶44、 0 2-整联蛋白、L-选择蛋白、⑶99和JAM。
[0059] 白细胞包括但不限于嗜中性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞。淋巴细胞包括B细胞 和T细胞。T细胞包括⑶4+、⑶8+、yST细胞和天然杀伤细胞。
[0060] 在内皮细胞中表达并被下调的细胞粘附分子包括但不限于E-选择蛋白VCAM、 ICAM(1、2)、P-选择蛋白、CD99、PECAM-1、JAM、ESAM和骨桥蛋白（VCAM的共同受体）。
[0061] 在一个实施方案中，在具有外伤性脑损伤的受试者中，内皮细胞上的I-CAM和 P-选择蛋白被上调。
[0062] 本发明涉及减少细胞粘附分子的表达。表达可以是细胞内和细胞外的，例如在内 皮细胞表面。因此，可减少表达，使得当内皮细胞培养时这些分子分泌进入细胞培养基减 少。细胞外和细胞表面表达包括在蛋白质水平上减少表达。细胞内表达包括减少细胞内的 转录和翻译。
[0063] 根据本发明，全部上述效应（即，炎症、外渗、白细胞黏附至内皮细胞、黏着分子的 表达等）的减少可通过以下方式实现：将所述白细胞和/或内皮细胞暴露于具有胚胎干细 胞的一些多能特性但衍生自非胚胎组织的非胚胎非生殖细胞。
[0064] 根据本发明，全部上述效应可通过给予细胞或由所述细胞条件化的培养基 (mediumconditionedbythecell)实现。细胞包括但不限于具有胚胎干细胞特性但衍 生自非胚胎组织的非胚胎非生殖细胞。这样的细胞可以是多能的并且表达多能标记物，例 如oct4、端粒酶、rex-1、rox_l、sox-2、nanog、SSEA-1 和SSEA-4 的一种或多种。其他多能 性特征可以包括分化为超过一个胚层，例如两个或三个的外胚层、内胚层和中胚层胚胎的 胚层的细胞类型的能力。这样的细胞可以永生化或在培养中转化，或者可以不永生化，也不 在培养中转化。这样的细胞可以高度扩增，同时不转化并且维持正常的核型。例如，在一个 实施方案中，所述非胚胎非生殖细胞可进行至少10-40次，例如30、40、50、60或更多次细胞 倍增，其中所述细胞没有转化并且具有正常的核型。所述细胞可以表达端粒酶活性以便实 现超过30次，例如35、40、45、50或更多次细胞群倍增（细胞倍增）。但是，如上所述，所述 细胞还能够表达〇ct4、端粒酶、rex-l、rox_l、sox_2、nanog、SSEA1或SSEA4的一种或多种。 这样的细胞可以分化为内胚层、外胚层和中胚层胚胎细胞系的两种的每种中的至少一种细 胞类型，并且可以包括分化成为所有三种胚层。此外，它们可以是致瘤的，或者可以不是致 瘤的，例如不产生畸胎瘤。如果细胞转化或者致瘤，并且需要将它们用于融合，这样的细胞 可被致缺陷以使它们不能在体内形成肿瘤，例如通过防止细胞增殖成为肿瘤的处理。这样 的处理在本领域是熟知的。这样的细胞可以自然地达到本文所述的效果（即，达到该效果 没有经过遗传学或药物学修饰）。但是，天然表达子可以被遗传学或药物学修饰以增加效 能。
[0065] 鉴于这些细胞实现以上效应的特性，所述细胞可被用于筛选调节所述细胞以实现 以上所述效应的能力的试剂的药物发现方法。这样的试剂包括但不限于小的有机分子、反 义核酸、siRNADNA适体、肽、抗体、非抗体蛋白质、细胞因子、趋化因子和趋化物。然后，所 述试剂可被用于增加所述细胞实现任意上述效应的效能。
[0066] 作为一个实例，该测定已经被用于鉴定用TNF-a、IFN_y或IL-10或它们的结合 物对细胞进行的预处理，所述预处理用于产生抑制内皮细胞分子的上调或者下调这些分子 的表达的细胞。一些细胞必须与活化的内皮细胞共同培养以产生下调黏附分子（或抑制上 调）的因子。因此，对照细胞（没有暴露于活化的内皮细胞）可被暴露于需要的试剂，然后 测定对它们对内皮细胞活化、黏附部分的表达或上述任意效应的作用。
[0067] 由于本申请描述的所述效应可以由从所述细胞分泌的因子引起，因此不仅细胞， 而且从培养所述细胞产生的条件化培养基（conditionedmedium)也可用于实现所述效应。 这样的培养基将包含所述分泌的因子，因此可被用于代替所述细胞或者添加至所述细胞。 因此，当可以使用细胞时，应理解所述培养基也是有效的，并且可被代替或加入。
[0068] 考虑到这些细胞实现上述效应的特性，可以建立细胞库，其包含因具有实现上述 效应所需的效能而被选出的细胞。因此，本发明包括测定这样的细胞实现上述任一效应的 能力，选择具有所需效能的细胞并将其建库。所述库可提供用于制备用于给予所述受试者 的药物组合物的源。可以从所述库中直接使用细胞，或者在使用前扩增。
[0069] 因此，本发明还涉及在将这些细胞给予受试者之前进行的诊断方法，所述预诊断 方法包括评估所述细胞实现一种或多种上述效应的能力。所述细胞可从细胞库中取出并且 直接使用，或者在给药前扩增。在两种情况下，都会对所述细胞评估所需要的效能。或者， 所述细胞可以来自于所述受试者并且在给药之前扩增。在这种情况下，在给药之前对所述 细胞评估所需效能。
[0070] 尽管对效性选择的细胞必然会在所述选择程序中进行测定，但是在给予所述受试 者用于治疗之前再次测定所述细胞以确保所述细胞在所需水平是否仍然有效，这是更适当 的并且是谨慎的。这在所述细胞已被储存一一例如在细胞库中，其中细胞在储存期间很可 能被冷冻一一任意时长的情况下尤其是更适当的。
[0071