MAPC还描述于美国申请No. 10/467, 963。
[0155] 这些参考文献因描述MAPC由Catherine Verfaillie首次分离出来而以引用的方 式纳入本文。
[0156] MAPC的分尚和?养
[0157]MAPC分离方法是本领域已知的。参加，例如，美国专利7, 015, 037和美国申请 No. 10/467, 963,这些方法连同MAPC的特征（表型）以引用的方法纳入本文。MAPC可从多 个源分离，所述源包括但不限于骨髓、胎盘、脐带和脐带血、肌肉、脑、肝脏、脊髓、血液或皮 肤。因此，可能获得骨髓抽吸物、脑或肝脏活检组织和其他器官，并且使用本领域技术人员 知晓的阳性或隐性选择技术，依赖这些细胞表达（或者不表达）的基因（例如，通过功能性 或形态学测定，例如上文参考的申请中公开的那些，所述申请以引用的方式纳入本文）分 离所述细胞。
[0158]美国专利7. 015. 037中描沭的来自人骨髓的MAPC
[0159]MAPC不表达共有的白细胞抗原⑶45或成红细胞特异血型糖蛋白-A(Gly-A)。将 细胞的混合群进行FicollHypaque分离。然后使用⑶45抗体和Gly-A抗体对细胞进行阴 性选择，去除CD45+和Gly-A+细胞的群，然后回收剩余的约0. 1 %的骨髓单核细胞。还可将 细胞铺板于纤连蛋白包被的孔中，并且如下文所述培养2-4周以去除CD45+和Gly-A+细胞。 在黏着骨髓细胞的培养物中，很多黏着基质细胞在约细胞倍增30次时发生复制性衰老，纯 度更高的细胞群继续扩增并且保持长的端粒。
[0160] 或者，可以使用阳性选择与细胞特异性标记物的结合分离细胞。阳性和阴性选择 技术都是本领域技术人员可以得到的，并且本领域可得到很多适于阴性选择目的的单克隆 和多克隆抗体（参见，例如，LeukocyteTypingV，Schlossman，etal.，Eds. (1995)Oxford UniversityPress)，其可从许多来源市购得到。
[0161] 从细胞群混合物中分离哺乳细胞的技术也已经由Schwartz等在美国专利 1^0.5,759,793(磁性分离）中，1^8〇11等，1 983(免疫亲和层析）和1780〇1^311(13&1：0， 1978 (荧光激活细胞分选）描述。
[0162]U.S. 7, 015, 037 中描沭的培养MAPC
[0163] 如本文描述分离的MAPC可以使用本文和美国专利7, 015, 037描述的方法培养，所 述专利因这些方法而以引用的方式纳入本文。
[0164] 细胞可在低血清或无血清培养基中培养。用于培养MAPC的无血清培养基描述于 美国专利7, 015, 037。已经在无血清和低血清培养基中培养了很多细胞。在这种情况下， 所述培养基补充了一种或多种生长因子。通常使用的生长因子包括但不限于骨形态发生 蛋白、碱性成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子和表皮生长因子。参见，例如，美国 专利No. 7, 169, 610、7, 109, 032、7, 037, 721、6, 617, 161、6, 617, 159、6, 372, 210、6, 224, 860、 6, 037, 174、5, 908, 782、5, 766, 951、5, 397, 706 和 4, 657, 866 ;全部都因对在无血清培养基 中培养细胞的教导而以引用的方式纳入本文。
[0165]另外的培养方法
[0166] 在另外的实验中，MAPC培养的密度可以是约100个细胞/cm2或约150个细胞/cm2 至约10000个细胞/cm2,包括约200个细胞/cm2至约1500个细胞/cm2至约2000个细胞/ cm2。所述密度可随种的不同而变化。此外，最佳密度可依赖于培养条件和细胞来源而变化。 本领域技术人员能够确定给定培养条件和细胞的最佳密度。
[0167] 同样，在培养的MAPC的分离、生长和分化期间的任何时间都可以使用低于约 10%，包括约1-5%，尤其是3-5 %的有效大气氧浓度。
[0168] 可在多种血清浓度下，例如约2-20%，培养细胞。可以使用胎牛血清。更高的血清 浓度可以与更低的氧压联合使用，例如，约15-20%。不必在黏附培养皿之前选择细胞。例 如，在Ficoll梯度离心之后，将细胞以例如250, 000-500, 000/cm2直接铺板。可以挑出黏 着集落，可以合并并且扩增。
[0169] 在一个实施方案中，在实施例中实验方法中使用的高血清（约15-20% )和低氧 (约3-5% )条件被用于细胞培养。具体地，将来自集落的黏着细胞以约1700-2300个细胞 /cm2的密度在18%血清和3%氧下（具有TOGF和EGF)铺板并传代。
[0170] 在针对MAPC的一个实施方案中，补充物是细胞因子或使得MAPC保持分化为所有 三个细胞系的组分。这可以通过未分化状态的特定标记物的表达来指示。MAPC，例如，组成 型表达Oct3/4(Oct3A)并且维持高水平的端粒酶。
[0171] 细朐培养
[0172] 对于下文列出的全部组分，参见U.S. 7, 015, 037,其因对这些组分的教导而以引用 的方式纳入本文。
[0173] 总的来说，可以在本领域熟知并且可以得到的培养基中维持并且扩增可用于本发 明的细胞。还考虑含哺乳动物血清的细胞培养基的补充物。还可以有利地使用其他补充物 来为细胞提供必需微量元素用于最优地生长和扩增。还可以有利地将激素用于细胞培养 物。还可以依赖于细胞类型和分化细胞的命运来使用脂质和脂质载体以补充细胞培养基。 还考虑使用饲养细胞层。
[0174] 还可在"3D"（聚集的）培养物中培养细胞。一个实例是2009年1月21日提交的 PCT/US2009/31528。
[0175] -旦在培养物中建立，细胞可被新鲜使用或者使用例如含40 %FCS和10%DMS0 的DMEM冷冻并储存为冻存物。对于培养的细胞制备冻存物的其他方法也是本领域技术人 员可获得的。
[0176] 药物制剂
[0177]U.S. 7, 015, 037因为对药物制剂的教导而以引用的方式纳入本文。在一些实施方 案中，细胞群存在于组合物中，所述组合物被改造适合并且适于递送，即是生理学相容的。
[0178] 在一些实施方案中，用于给予受试者的细胞的纯度（或条件化培养基）是约100% (基本同质）。在另一些实施方案中，它是95%至100%。在一些实施方案中，它是85% 至95%。具体地，在与其他细胞的混合物的情况下，所述百分比可以是约10%-15%、 15%-20 %,20%-25 %,25%-30 %,30%-35 %,35%-40 %,40%-45 %,45 % -50 %, 60% -70 %、70 % -80 %、80 % -90 %或90 % -95%。或者，分离/纯化可以细胞倍增的方式 表达，其中所述细胞已经经历了例如10-20、20-30、30-40、40-50或更多次的细胞倍增。
[0179] 对于给定应用，用于给予所述细胞的制剂的选择将依赖于多种因素。其中主要的 因素是受试者的种类；待治疗的病症的性质，它的状态和在所述受试者中的分布；给予的 其他疗法和试剂的性质；给药的最佳路径；经所述路径的耐受性；给药方案和对于本领域 技术人员明显的其他因素。例如，合适载体和其他添加剂的选择会依赖于给药的确切路径 和具体给药形式的性质。
[0180] 细胞/培养基的水性悬浮液的最终配制一般包括将所述悬浮液的离子强度调节 至等渗（即，约0. 1至0. 2)并且调节至生理pH(即，约pH6. 8至7. 5)。最终制剂一般还会 包含流体润滑剂。
[0181] 在一些实施方案中，细胞/培养基被配制为单位给药剂量可注射形式，例如溶液 剂、悬浮剂或乳剂。适于注射细胞/培养基的药物制剂一般是无菌的水性溶液和分散体。可 注射制剂的载体可以是包含例如以下物质的溶剂或分散介质：水、盐水、磷酸缓冲的盐水、 多元醇（例如甘油、丙二醇、液态聚乙二醇等）及其合适的混合物。
[0182] 本领域技术人员可以容易地确定本发明的方法中给予的组合物中的细胞和可选 的添加剂、运载体和/或载体的量。一般地，任意添加剂（除所述细胞之外）存在的量为在 溶液中（例如在磷酸缓冲的盐水中）〇. 〇〇1至50wt%。活性成分以毫克至微克的级别存在， 例如为约0. 001至约5wt%，优选约0. 0001至约lwt%，最优选为约0. 0001至约0. 05wt% 或者约0. 001至约20wt%，优选约0. 01至约10wt%，最优选为约0. 05至5wt%。
[0183] 细胞的给药剂量可在很大范围内变化，并且在每种具体情况下会适合个体需求。 一般地，肠胃外给药的情况下，常规地给予约1万个至约2千万个细胞/kg接受者体重。细 胞的数量将随着以下因素变化：接受者的体重和病症、给药的次数或频率以及本领域技术 人员已知的其他可变因素。可通过适于所述组织或器官的途径给予所述细胞。例如，它们 可被全身给予，即，通过静脉给予而肠胃外给予；或者可以被靶向具体的组织或器官；它们 可被通过皮下给予或通过给予具体的所需组织而给药。
[0184] 所述细胞可以约0. 01X106个至约5X10 6个细胞/ml的浓度悬浮于合适的赋形剂 中。对于注射溶液适合的赋形剂是与细胞和接受者生物学和生理学相容的赋形剂，例如缓 冲的盐水溶液或其他合适的赋形剂。用于给药的所述组合物可根据符合适当的无菌性和稳 定性的标准方法而配制、生产和存储。
[0185] 对淋巴诰血组织给药
[0186] 对这些组织给药的技术是本领域已知的。例如，骨髓内注射可以包括将细胞直接 注射进入（一般为）髂后嵴的骨髓腔，但是还可以包括髂嵴的其他部位、股骨、胫骨、肱骨或 尺骨的骨髓腔；脾脏注射可以包括在射线拍照指导下注射进入脾脏，或者通过腹腔镜或剖 腹术手术暴露脾脏；派尔淋巴集结、GALT或BALT注射可以要求剖腹术或腹腔镜注射过程。
[0187] MS
[0188] 对于人或其他哺乳动物的剂量可无需过度实验由本领域技术人员从本公开内容、 本文引用的文献和本领域知识确定。适合用于本发明的各个实施方案的细胞/培养基的剂 量会依赖于许多因素。确定主要和辅助疗法给予的最佳剂量的参数一般会包括以下一些和 全部：待治疗的疾病及其阶段；受试者的种类、其健康情况、性别、年龄、体重和代谢速率； 受试者的免疫活性；给予的其他治疗法；和从所述受试者的病史或基因型预测的潜在并发 症。所述参数还包括：所述细胞是否是同基因、自体同源、同种异体或者异种；它们的能力 (具体活性）；所述细胞/培养基若要有效而必须靶向的位点和/或分布；以及所述位点的 如下特性，例如细胞/培养基的可接近性和/或细胞的植入。其他参数包括与其他因子（例 如生长因子和细胞因子）共给予。给定情况的最佳剂量还将考虑制备所述细胞/培养基的 方式，给予所述细胞/培养基的方式，以及所述细胞/培养基在给药之后在所述靶部位的局 部化的程度。
[0189] 细胞的最佳剂量可以在用于自体同源单核骨髓移植的剂量范围内。对于细胞的基 本纯制品，多个实施方案中的最佳剂量的范围是每次给药1〇 4至108个细胞/kg的接受者体 重。在一些实施方案中，每次给药的最佳剂量为1〇5至10 7个细胞/kg。在很多实施方案中， 每次给药的最佳剂量为5X105至5X10 6个细胞/kg。作为参考，前述的更高剂量类似于自 体同源单核细胞骨髓移植中使用的有核细胞的剂量。一些更低的剂量类似于自体同源单核 骨髓移植中使用的CD34+个细胞/kg的数目。
[0190]在多个实施方案中，可以以初始剂量给予细胞/培养基，之后通过进一步给药维 持。初始可用一种方法给予细胞/培养基，之后通过相同的方法或一种或多种不同的方法 给予。可通过进行的所述细胞/培养基给药来维持所述水平。多个实施方案通过静脉注射 初始给予所述细胞/培养基或者在所述受试者中维持其水平，或者初始给予所述细胞/培 养基并且维持所述细胞/培养基水平。在多个实施方案中，依赖于患者的病症和其他因素 (在本文他处描述）可使用其他形式的给药。
[0191] 细胞/培养基可以多种频率在很宽范围的时间段给予。一般地，治疗的时长会与 所述疾病过程的时长、实行的治疗的有效性和接受治疗的受试者的病症和反应成比例。
[0192] 里途
[0193] 由于本发明的细胞分泌一种或多种因子，所述因子通过本申请描述的多种生物学 机制最终减少炎症，因此给予所述细胞可用于减少如上所列的任意数目的病理中不想要的 炎症。
[0194]此外，由本申请描述的生物学机制提供了其他用途。这些用途中的一种包括药物 发现。该方面包括就调节所述细胞的抗炎效应的能力筛选一种或多种化合物。这将包括，首 先，针对细胞减少以下任一情况的能力开发测定法：（1)炎症，（2)外渗，（3)内皮细胞-白 细胞结合，（4)黏着分子在内皮细胞中的表达（RNA和/或蛋白质），（5)与所述黏着细胞分 子结合的相关配体（位于白细胞上）的表达，前提是该配体的表达受到内皮细胞的调节，和 (6)内皮细胞的细胞因子产生。因此，该测定法可被设计为在体内或在体外进行。调节测 定可评估任意所需水平，例如形态学、基因表达、功能等，的活化状态。它可能包括分离的血 管内皮。或者，它可能包括从内皮部分地或者完全地移除的血管内皮细胞，包括内皮细胞株 (strain)和内皮细胞系（line)，可以是天然的或重组的。但是，它还可以包括已知具有结 合亲和性的分离的细胞组分，例如内皮上表达的黏着分子和见于白细胞上的它们的相应结 合配体。因此，表达或分泌所述细胞粘附分子的重组细胞和相应的白细胞配体可被用于检 测结合。或者，所述分离的淋巴细胞结合伴侣可与表达内皮黏着分子的细胞一起使用，例如 P-选择蛋白或E-选择蛋白和CD15s;ICAM-1 或ICAM-2 和LFA-1 ;ICAM和Mac-1 ;VCAM-1 和 VLA-4。
[0195]所述测定可以包含活性细胞因子，例如TNF-a或IL-10。仅所述细胞因子即可构 成所述测定的基础。例如，可对所述细胞/培养基测定结合TNF-a的能力，或者在基于细 胞的受体测定或者可溶受体测定中作为TNF-a受体的竞争抑制剂起作用的能力。非结合 TNF-a可被直接检测，或者非结合TNF-a的测定可以包括针对TNF-a的任意生物学效应 的测定。这还可以适用于其他活性细胞因子，例如IL-1。
[0196] 或者，所述测定可以包括在基于受体的测定中所述细胞/培养基调节（增加、降 低）NFkB的能力，所述基于受体的测定具有与由NFkB控制的启动子可操作地连接的报告 基因。然后所述测定可被用于筛选增加或者降低所述细胞/培养基的效应的化合物/试剂。
[0197] 可以通过直接测定蛋白质或DNA来估计基因表达。这可以通过本领域熟知的任意 技术进行，例如通过FACS和其他基于抗体的检测方法和PCR以及其他基于杂交的检测方法 进行。间接检测也可以用于表达，例如结合至任意已知的结合伴侣。
[0198]对表达/分泌的测定包括但不限于ELISA、Luminex、qRT-PCR、因子抗体蛋白质印 迹和在组织样本和细胞上的因子免疫组织化学。
[0199] 细胞和条件化培养基中的调节因子的定量确定可以使用市售试剂盒（例如，依赖 两步骤的基于消减抗体的测定（subtractiveantibody-basedassay)的R&D系统）来进 行。
[0200] 本发明包括产生具有本文描述的增加效应的细胞的方法。因此，本发明包括鉴别 化合物的方法，所述化合物增加所述细胞具有本文描述任意效应的能力，所述方法通过将 所述细胞暴露于化合物并且检测所述细胞达到任意需要水平所述效应的能力来进行。在一 个实施方案中，一些细胞可能需要在产生具有本文描述的效应的因子之前与活化的内皮细 胞接触。这样的细胞可被指定为"对照"。因此，在一个实施方案中，可能通过使用适于本文 描述的药物递送的化合物代替活化的内皮细胞的作用。在一个实施方案中，例如，发明人发 现IL-lf3、TNF-a和IFN-Y的结合物可以代替用于与活化的内皮细胞接触，这在实施例部 分简要地描述。因此，可用任意数目的化合物对细胞进行筛选以鉴定允许该代替的化合物。 然后，对于本申请描述的任何治疗用途，以及对于产生可用于临床、治疗和诊断应用和细胞 库的组合物和细胞建库，可将这些化合物用于预处理对照细胞。
[0201] 具体测宙的实例
[0202] 1.内皮细胞的FACS分析以在与MAPC共培养或者与来自MAPC的条件化培养基孵 育之后检测黏着分子的存在情况。
[0203] 2.对结合至与MAPC共培养或者与来自MAPC的条件化培养基孵育的内皮细胞的嗜 中性粒细胞定量。
[0204] 3.对使用基于启动子的系统在与MAPC共培养或者与来自MAPC的条件化培养基孵 育之后对NF-kB活性定量。
[0205] 4.在内皮层与MAPC共培养或者与来自MAPC的条件化培养基孵育之后，使用基于 ECIS的系统或类似系统对通过所述内皮层的白细胞外渗定量。
[0206] 还可以通过检测由所述细胞分泌的活性因子来进行效能测定。所述活性分子包括 糖皮质激素、fffi-EGF、IL-10、前列腺素Al、IL-13、IL-1R、IL-18R、IFN-R、TNF-R1、TNF-R2、 IL-4、IL-ll、IFN-0、TGF-0 1、0 2、0 3、前列腺素E2、SPP1、CYLD、弹性蛋白酶、VEGF、IL-33、 胸腺素B4和TGF-0肾上腺髓质肽。检测可以是直接的，例如通过RNA或蛋白质测定；或者 是间接的，例如，对这些因子的一种或多种生物学效应进行生物学测定。
[0207] 本发明的另一个用途是建立细胞库以提供用于临床给药的细胞。一般地，该方法 的一个基本部分是提供用于在多种治疗临床情况下给药的具有所需效能的细胞。
[0208] 可用于药物发现的任意相同测定法还可被应用于为所述库选择细胞以及选择来 自所述库的细胞用于给药。
[0209] 因此，在建库过程中，将对所述细胞（或培养基）检测实现任意上述效应的能力。 然后，将选择具有任意上述效应能力的细胞，这些细胞将形成用于产生细胞库的基础。
[0210] 还考虑通过用外源化合物处理来增加效能，所述化合物例如通过用大的组合库筛 选细胞发现的化合物。这些化合物库可以是试剂库，所述试剂包括但不限于小有机分子、反 义核酸、siRNADNA适体、肽、抗体、非抗体蛋白质、细胞因子、趋化因子和趋化物。例如，细 胞可在培养和制备过程中的任意时间暴露于这样的试剂。唯一需要是有足够数目的所需测 定可以进行以评估所述试剂是否增加效能。在上文描述的一般的药物发现方法中发现的此 种试剂可以更有利地应用于建库存前的最后传代过程中。
[0211] 从合格的骨髓供体分离细胞，所述合格的骨髓供体已经接受了特定的测试要求以 确定从该供体得到的细胞产物可安全地在临床情况下使用。使用手工或自动化方法分离所 述单核细胞。将这些单核细胞置于培养物中，使得这些细胞黏附至处理的细胞培养容器表 面。可使MAPC细胞在处理的表面扩增，在第2天和第4天更换培养基。在第6天，通过机 械方法或酶法将细胞从所述处理的基质中移除，并且重铺于另一个处理的细胞培养容器的 表面。在第8天和第10天，如前将所述细胞从所述处理的表面移除并且进行重铺。在第13 天，将所述细胞从所述处理的表面移除，洗涤并且与冷冻保护材料结合，并且最后在液氮中 冷冻。在所述细胞冷冻至少1周之后，取出等份的细胞用于效能、类型、无菌性测试以及其 他测试以确定所述细胞库的可用性。然后，该库中的这些细胞可通过解冻这些细胞、将它们 置于培养物中来使用或者在解冻之后使用以治疗潜在的症状。
[0212] 另一个用途针对给予所述细胞之后的效能和有益临床效应的诊断测定。依赖于所 述症状，可能有可用于评估的生物标记物。例如，高水平的C-反应蛋白与急性炎症应答有 关。可以监测CRP的水平来确定有益临床效果。
[0213] 另一个用途是评估细胞达到上述任意结果的效力，所述评估作为将所述细胞给予 受试者之前的治疗前诊断。
[0214] 组合物
[0215] 本发明还涉及细胞群，其具有实现本文描述的任意效应的具体效能（即，炎症、外 渗、黏附、减少内皮活化等）。如上所述，这些群是通过选择具有所需效能的细胞建立的。这 些群被用于制备其他组合物，例如，包含具有具体所需效能的群的细胞库和包含具有具体 所需效能的细胞的药物组合物。
[0216] 实施例
[0217] 实施例1
[0218] MultiStem?是在本文实施例中描述的实验方法中使用的MAPC细胞制品的商标 名称。
[0219]多能成体祖细朐在活化后调节内皮细朐粘附分子表而表汰并目在AMI之后减小 炎症
[0220] 依据/背景
[0221] 免疫细胞定位于炎症位点是对损伤和感染的免疫应答的重要部分。在对炎症的应 答中，免疫细胞（包括白细胞、淋巴细胞和单核细胞）结合至并且变异通过内皮细胞层到 达损伤位点U。内皮细胞可被凝血酶、组胺和促炎细胞因子（例如，T