，更优选至少1000种这样的细胞，甚至更优选至少 10000种这样的细胞。处理之后，该子群体可通过已知的细胞分选技术从所述异质群体中回 收，如果需要可以进一步扩增。
[0122] 因此，所述效应的需要水平可以是比给定在先群体的水平高的水平。例如，从组织 置于原代培养物中并且通过培养条件扩增并分离的细胞可提供亲代群体，所述培养条件没 有特地设计为具有所述效应。这样的亲代群体可被处理以增强每细胞的平均效应，或者被 筛选以得到所述群体中表达更高效应的一种或多种细胞。然后可将这样的细胞扩增以提供 具有更高（需要的）效应的群体。
[0123] "自我更新"是指产生复制子代干细胞的能力，所述子代干细胞具有与自身来自的 细胞相同的分化潜能。本文中使用的类似术语是"增殖"。
[0124] "干细胞"是指可以进行自我更新（S卩，子代具有相同的分化潜能）并且还可 以产生分化潜能更有限的子代细胞的细胞。在本发明的上下文中，干细胞还可以包括分 化程度更高的细胞，其已经通过例如以下方式去分化：通过核移植、通过与更原始的干细 胞融合、通过导入特定的转录因子或者通过在特定条件下培养。参见，例如，Wilmutet al. ,Nature, 385:810-813(1997)；Yingetal. ,Nature, 416:545-548(2002)；Guanet al. ,Nature, 440:1199-1203 (2006)；Takahashietal. ,Cell, 126:663-676(2006)；Okita etal.，Nature, 448:313-317 (2007);和Takahashietal.，Cell, 131:861-872 (2007)。
[0125] 去分化还可以通过给予一些化合物或暴露于在体内或体外可以引起去分化的物 理环境而引起。干细胞还可以来自异常组织，例如畸胎癌和一些其他来源，例如胚状体（但 是这些可被认为是胚胎干细胞，因为它们来自胚胎组织，尽管不是直接来自于内细胞团）。 干细胞还可以通过将与干细胞功能相关的基因导入非干细胞中而产生，例如，诱导性多能 干细胞。
[0126] "受试者"是指脊椎动物，例如哺乳动物，例如人。哺乳动物包括但不限于人、狗、 猫、马、牛和猪。
[0127] 术语"治疗有效量"是指在哺乳动物中被确定产生任何治疗反应的试剂量。例如， 有效的抗炎治疗剂可以延长患者的存活，并且/或者抑制明显的临床症状。在本文使用的 所述术语含义内的治疗有效的治疗包括改善患者的生活质量的治疗，即使它们没有改善疾 病结果本身。这样的治疗有效量很容易由本领域普通技术人员确定。因此，"治疗"是指送 递这样的量。因此，治疗可以防止或改善炎症的任意病理症状。
[0128] 本发明中广泛使用术语"治疗（"Treat'"treating"或"treatment"）"，其主要 包括防止、改善、抑制或者治愈缺陷、机能障碍、疾病或其他有害的过程，包括治疗干扰的和 /或产生于治疗的那些。
[0129] 干细朐
[0130] 本发明可以优选地使用脊椎动物的干细胞进行，所述脊椎动物例如人、非人灵长 类、驯养动物、家畜和其他非人哺乳动物。这些包括但不限于下文描述的那些细胞。
[0131] 杯胎干细朐
[0132] 研宄最透彻的干细胞是胚胎干细胞（ESC)，因为它具有无限的自我更新能力和多 能分化潜能。这些细胞可以源自胚泡的内细胞团，或者可以源自移植后胚胎的原始生殖 细胞（胚胎生殖细胞或EG细胞）。ES和EG细胞首次从小鼠中得到，之后从很多不同的 动物中得到，最近，还从非人灵长类和人中得到。当ESC被导入小鼠胚泡或者其他动物的 胚泡中时，ESC可以成为所述动物的所有组织。ES和EG细胞可通过用抗SSEA1(小鼠） 和SSEA4(人）的抗体阳性染色来鉴别。参见，例如，美国专利No. 5, 453, 357、5, 656, 479、 5, 670, 372、5, 843, 780、5, 874, 301、5, 914, 268、6, 110, 739、6, 190, 910、6, 200, 806、 6, 432, 711、6, 436, 701、6, 500, 668、6, 703, 279、6, 875, 607、7, 029, 913、7, 112, 437、 7, 145, 057、7, 153, 684和7, 294, 508,各自因其胚胎干细胞的教导和制备和扩增所述胚胎 干细胞的方法而通过引用的方式纳入本文。因此，ESC及其分离和制备方法是本领域熟知 的。
[0133] 已经鉴定了许多影响胚胎干细胞在体内的效能状态的转录因子和外源性细胞因 子。被描述参与干细胞多能性的首个转录因子是0ct4。0ct4属于POU(Pit-Oct-Unc)转录 因子家族，是能够活化基因转录的DNA结合蛋白，包含被称为启动子或增强子区域内的"八 聚体基序"的八聚序列。
[0134] 0ct4在受精卵的分裂期表达，直到卵圆柱形成。0ct3/4的功能是抑制分化诱导 基因（即，FoxaD3、hCG)并且活化促进多能性的基因（FGF4、Utfl、Rexl)。Sox2--高迀移 率族（HMG)盒转录因子的一个成员一一与0ct4协作活化内细胞团中表达的基因的转录。 0ct3/4在胚胎干细胞中的表达维持在具体水平之间是必要的。0ct4表达水平>50%的过表 达或者下调将改变胚胎干细胞命运，分别为形成原始内胚层/中胚层或滋养外胚层。在体 内，0ct4缺陷胚胎可发育至胚泡期，但是内细胞团细胞不是多能的。相反，它们沿着胚胎外 滋养层系分化。Sall4--哺乳动物Spalt转录因子--是0ct4的上调调节子，因此对于 在胚胎早期维持合适的0ct4水平是重要的。当Sall4水平下降至低于某一阙值时，滋养外 胚层细胞将异位扩增至内细胞团。多能性需要的另一个转录因子是Nanog，是以Celtic部 族"TirNanOg":永远年轻的土地，命名的。在体内，Nanog从致密桑葚胚期表达，之后被限 制在内细胞团中，并且在植入期下调。Nanog的下调对于在原肠胚形成过程中避免多能细胞 不受控的扩增和允许多细胞系分化可能是重要的。第5. 5天分离的Nanog无效胚胎由无序 胚泡构成，主要包含胚胎外内胚层和无法辨认的上胚层。
[0135] 非杯胎干细朐
[0136] 已在大部分组织中鉴别到干细胞。可能最清楚表征的是造血干细胞（HSC)。HSC 是来自中胚层的细胞，可以使用细胞表面标记物和功能特性来纯化。它们已经被从骨髓、外 周血、脐带血、胎肝和卵黄囊中分离。它们起始造血作用并且产生多种造血细胞系。当它们 被移植进入致死量放射线照射的动物中时，它们能够再造红系嗜中性粒细胞-巨噬细胞、 巨核细胞和淋巴造血细胞库。它们还能被诱导进行一些自我更新细胞分裂。参见，例如， 美国专利No. 5, 635, 387、5, 460, 964、5, 677, 136、5, 750, 397、5, 681，599 和 5, 716, 827。美 国专利No. 5, 192, 553报道了分离人新生儿或胎儿造血干细胞或祖细胞的方法。美国专利 No. 5, 716, 827报道了作为Thy-1+祖细胞的人造血干细胞，以及在体外再生它们的合适生长 培养基。美国专利No. 5, 635, 38报道了用于培养人干细胞和它们的前体的方法和装置。美 国专利No. 6, 015, 554描述了重建人淋巴和树突细胞的方法。因此，HSC及其分离和扩增方 法是本领域熟知的。
[0137] 本领域熟知的另一种干细胞是神经干细胞（NSC)。这些细胞可在体内增殖并 且连续地再生至少一些神经细胞。当离体培养时，神经干细胞可被诱导增殖以及分化 为不同类型的神经元和神经胶质细胞。当神经干细胞被移植至脑时，其能够植入并且 产生神经细胞和神经胶质细胞。参见，例如GageF.H.，Science, 287:1433-1438(2000) ，SvendsenS.N.etal,BrainPathology, 9:499-513 (1999)，和OkabeS.etal.，Mech Development, 59:89-102 (1996)。美国专利No. 5, 851，832报道了从脑组织中得到的多能神 经干细胞。美国专利No. 5, 766, 948报道了从新生儿大脑半球中产生神经母细胞。美国专利No. 5, 564, 183和5, 849, 553报道了哺乳动物神经嵴干细胞的用途。美国专利No. 6, 040, 180 报道了在体外从哺乳动物多能CNS干细胞的培养物中产生分化神经元。W0 98/50526和W0 99/01159报道了神经上皮干细胞、少突星型胶质细胞前体和细胞系受限神经元前体的再生 和分离。美国专利No. 5, 968, 829报道了从胚胎前脑得到的神经干细胞。因此，神经干细胞 及其制备和扩增方法是本领域熟知的。
[0138] 本领域已经大量研宄的另一种干细胞是间充质干细胞（MSC)。MSC来自于胚胎中 胚层，可从多种来源分离，主要包括成体骨髓、外周血、脂肪、胎盘和脐带血。MSC能够分化成 为很多中胚层组织，包括肌肉、骨、软骨、脂肪和腱。关于这些细胞有大量的文献。参见，例 如，美国专利No. 5, 486, 389、5, 827, 735、5, 811，094、5, 736, 396、5, 837, 539、5, 837, 670 和 5,827,740。还可见于PUtenger，M.etal,Science, 284:143-147 (1999)〇
[0139] 成体干细胞的另一个实例是脂肪衍生的成体干细胞（ADSC)，其已被从脂肪，常规 地通过吸脂术，之后使用胶原酶释放ADSC而分离。ADSC在很多方面类似于源自骨髓的MSC， 不同的是能够从脂肪中分离更多细胞。已经报道这些细胞可以分化成为骨、脂肪、肌肉、软 骨和神经元。U.S. 2005/0153442描述了一种分离方法。
[0140] 本领域已知的其他干细胞包括胃肠干细胞、表皮干细胞和肝脏干细胞，其也被称 作"卵形细胞"（P〇tten，C.，etal.，TransRSocLondBBiolSci, 353:821-830 (1998 ),Watt,F. ,TransRSocLondBBiolSci,353:831 (1997)；Alisonetal. ,Hepatolo gy,29:678-683(1998))〇
[0141] 报道的能够分化成为超过一种胚胎胚层的细胞类型的其他非胚胎细胞包括 但不限于来自脐带血的细胞（参见美国公布No. 2002/0164794)、来自胎盘的细胞（参 见美国公布No. 2003/0181269)、来自脐带血基质的细胞（Mitchell,K.E.etal.,Stem Cells, 21:50-60 (2003))、来自小胚胎样干细胞的细胞（Kucia，M.etal.，JPhysiol Pharmacol，57Suppl5:5-18(2006))、来自羊水干细胞的细胞（Atala，A.，JTissue RegenMed, 1:83-96 (2007))、来自皮肤衍生的前体的细胞（Tomaetal.，NatCell Biol, 3:778-784(2001))和来自骨髓的细胞（参见美国公布No. 2003/0059414和 2006/0147246)，其各自因对这些细胞的教导以引用的方式纳入本文。
[0142] 重编稈体细朐的方法
[0143] 已经使用了一些不同的方法，例如核移植、细胞融合和培养诱导的重编程，来诱 导分化的细胞转化为胚胎状态。核移植包括将体细胞核注射进入去核卵母细胞，当起被 移植进入代理母亲时，可以形成克隆（"生殖性克隆"），或者当在培养物中扩增时，可以 形成遗传匹配的胚胎干（ES)细胞（"体细胞核移植"，SCNT)。体细胞与ES细胞的细胞 融合致使产生显示多能ES细胞的全部特性的杂合体。培养物中的体细胞外植可选择用 于可以是多能（pluripotentormultipotent)的无限繁殖细胞系。目前，精原细胞干细 胞是可衍生自出生后动物的多能干细胞的唯一来源。用规定的因子转导体细胞可以起 始重编程至多能状态。对这些试验方法有大量综述（HochedlingerandJaenisch，Natu re, 441:1061-1067(2006)andYamanaka，S.，CellStemCell, 1:39-49 (2007))〇
[0144] 核務棺
[0145] 核移植（NT)，也被称作体细胞核移植（SCNT)，是指将来自供体体细胞的核导入去 核卵母细胞以产生克隆动物，例如多莉羊（Wilmutetal.，Nature, 385:810-813(1997))。 通过NT产生活的动物证明了体细胞的外遗状态，包括终末分化的细胞的外遗状态，尽管 是稳定的，也不是不可逆地固定的，而是可以重编程至胚胎状态，其能够指导新生物体的发 育。除了对阐释胚胎发育和疾病中涉及的外遗传机制提供令人兴奋的实验方法外，核克隆 技术具有用于患者特异移植医学的潜在益处。
[0146] 体细朐和杯胎干细朐的融合
[0147] 将体细胞核外遗传重编程至未分化状态已经在通过胚胎细胞和体细胞融合产 生的小鼠杂合体中被证明。多种体细胞和胚胎癌细胞的杂合体（Solter，D.，NatRev Genet, 7:319-327 (2006))、胚胎生殖细胞（EG)或ES细胞（ZwakaandThomson,Developme nt，132:227-233(2005))有很多与亲本胚胎细胞相同的特性，表明多能表型在这样的融合 产物中是主要的。对于小鼠（Tadaetal.，CurrBiol, 11:1553-1558(2001))，人ES细胞 具有在融合之后重编程体细胞核的潜能（Cowanetal.，Science, 309:1369-1373 (2005)); Yuetal.，Science, 318:1917-1920 (2006))。沉默多能标记物例如0ct4的活化，或者失活 体细胞X染色体的再活化为体细胞基因组在杂合细胞中重编程的分子证据。已经提出DNA 复制对于在融合后2天首次观察到的多能标记物的活化是必要的（DoandScholer,Stem Cells, 22:941-949 (2004))，以及，当与神经干细胞融合时，Nanog在ES细胞中的强制过表 达可促进多能性（Silvaetal.，Nature, 441:997-1001 (2006))〇
[0148] 培养物诱导的重编程
[0149] 已经从胚胎源得到了多能细胞，所述胚胎源例如卵裂球和胚泡的内细胞 团（ICM) (ES细胞）、上胚层（EpiSC细胞）、原始生殖细胞（EG细胞）和出生后精 原细胞干细胞（"maGSCsm"，"ES-样"细胞）。以下的多能细胞，与它们的供体细 胞/组织一起，描述如下：单性生殖ES细胞（parthogeneticEScell)来自小鼠卵 母细胞（Narasimhaetal.，CurrBiol, 7:881-884 (1997));胚胎干细胞来自卵裂 球（Wakayamaetal.，StemCells, 25:986_993(2〇〇7));内细胞团（来源不适用） (Egganetal.，Nature, 428:44-49(2004));胚胎生殖细胞和胚胎癌细胞来自原始生 殖细胞（Matsuietal.,Cell, 70:841-847(1992)) ;GMCS、maSSC和MASC来自精原 细胞干细胞（Guanetal.,Nature, 440:11"-12〇3(2〇〇6) ;Kanatsu_Shinoharaet al.，Cell, 119:1001-1012(2004);和Seandeletal.，Nature, 449:346-350(2007)); EpiSC细胞来自上胚层（Bronsetal.，Nature, 448:191-195(2007);Tesaret al.，Nature，448:196-199 (2007));单性生殖ES细胞来自人卵母细胞（Cibelliet al.,Science,295L819 (2002)；Revazovaetal. ,CloningStemCells, 9:432-449(2007))； 人ES细胞来自人胚泡（Thomsonetal.,Science, 282:1145-1147 (1998));MAPC来 自骨髓（Jiangetal.，Nature, 418:41-49(2002);PhinneyandProckop,Stem Cells，25:2896-2902(2007));脐带血细胞（来自脐带血）（andeVenetal.，Exp Hematol, 35:1753-1765 (2007));神经球（neurosphere)衍生的细胞来自神经细胞（Clarke etal.，Science, 288:1660-1663 (2000))。来自生殖细胞系的供体细胞，例如PGC或精原 细胞干细胞已知在体外是单能性的，但是已证明多能ES样细胞（Kanatsu-Shinoharaet al.，Cell， 119:1001-1012(2004))或maGSC(Guanetal.，Nature，440:1199-1203(2006)) 在体外长时间培养后可被分离。尽管大部分这些多能细胞类型能够在体外分化和形成畸 胎瘤，但依据更严格的标准，仅ES、EG、EC和精原细胞干细胞衍生的maGCS或ES样细胞是 多能的，因为它们能够形成出生后嵌合体并且成为生殖细胞系。最近，多能成体精原细胞 干细胞（MASC)可从成体小鼠的睾丸精原细胞干细胞中得到，并且这些细胞具有与ES细胞 不同（Seandeletal.，Nature, 449:346-350(2007))但是与EpiSC细胞类似的表达谱，所 述EpiSC细胞来自小鼠胚胎移植后的上胚层（Bronsetal.，Nature, 448:191-195 (2007); Tesaretal. ,Nature, 448:196-199(2007))〇
[0150] 通讨规宙的转录闵子重编稈
[0151]Takahashi和Yamanaka已经报道了将体细胞重编程回ES样状态（Takahashiand Yamanaka,Cell, 126:663-676(2006))。在将 4 种转录因子 0ct4、Sox2、c-myc和Klf4 进 行病毒介导的转导，之后针对0ct4靶基因Fbxl5的活化进行选择之后，他们成功地将小 鼠胚胎成纤维细胞（MEF)和成体成纤维细胞重编程为多能ES样细胞（图2A)。具有活化 的Fbxl5的细胞是制造的iPS(诱导性多能干）细胞并且通过它们形成畸胎瘤的能力显示 是多能的，但是它们不能产生活的嵌合体。这种多能状态依赖于转导的0ct4和Sox2基因 的连续病毒表达，而内源0ct4和Nanog基因或者不表达，或者以比ES细胞中低的水平表 达，并且发现它们各自的启动子大量甲基化。这与以下结论一致，即Fbxl5-iPS细胞与ES 细胞并不一致，但是可能代表了重编程的不完全状态。尽管遗传实验已经确定了 0ct4和 Sox2对于多能性是必需的（ChambersandSmith,Oncogene, 23:7150-7160(2004);Ivanona etal. ,Nature, 442:5330538(2006)；Masuietal. ,NatCellBiol, 9:625-635 (2007)), 但是两种癌基因c_myc和Klf4在重编程中的作用仍不清晰。一些这些癌基因实际上对 于重编程是可省去的，因为已经在不存在c-myc转导的情况下得到了小鼠和人iPS细 胞，尽管效能较低（Nakagawaetal.，NatBiotechnol, 26:191-106(2008);Werninget al.，Nature, 448:318-324 (2008);Yuetal.，Science, 318:1917-1920 (2007))〇
[0152] MAPC
[0153]MAPC是"多能成体祖细胞"的首字母缩略词（非-ES，非-EG，非生殖细胞）。 MAPC具有分化为至少两种，例如所有三种，原胚层（外胚层、中胚层和内胚层）的细胞类 型的能力。见于ES细胞的基因也可见于MAPC(例如，端粒酶、Oct3/4、rex-1、rox-1、 sox-2)。Oct3/4(人中Oct3A)看起来是ES和生殖细胞特异的。MAPC代表比MSC更原 始的祖细胞群（Verfaillie,C.M.，TrendsCellBiol12:502-8(2002)，Jahagirdar，B. N. ,etal. ,ExpHematol, 29:543-56(2001) ；Reyes,M.andCM.Verfaillie,AnnNYAcad Sci，938:231-233(2001) ;Jiang,Y.etal.,ExpHematol, 30896-904 (2002) ; *CJiang，Y. etal. ,Nature, 418:41-9. (2002) )〇
[0154] 人MAPC描述于美国专利7, 015, 037和美国申请No. 10/467,963。已经在其他哺乳 动物中鉴定了MAPC。例如，鼠MAPC描述于美国专利7, 015, 037和美国申请No. 10/467, 963。 大鼠