NF-a和白细胞介素 10)以及氧自由基活化，这可导致黏着分子（包括E-选择蛋白、V-CAM和I-CAM-1)的上调 3_5。内皮细胞表面细胞粘附分子的上调可使活化的免疫细胞黏附、滚动并且变移穿过内皮 细胞屏障 4。
[0222] 尽管免疫系统的动员是对感染和对伤口愈合的免疫应答的关键部分，缺血性损伤 后的炎症可促使细胞毒性和死亡。例如，在急性心肌梗死之后，嗜中性粒细胞浸润的增加与 用溶血栓疗法和初级血管形成术治疗的患者中有害事件的风险增加有关 6'对心肌梗死的 炎症应答程度对确定梗死大小以及之后的左心室（LV)重塑具有重要作用9'1(1。嗜中性粒细 胞定位至心脏通过释放蛋白酶和活性氧自由基（ROS)促进心肌损伤，所述蛋白酶和活性氧 自由基可促进左心室重塑。此外，嗜中性粒细胞通过在被描述为"无再流（noreflow)"的 现象中阻断毛细血管而促进微血管和毛细血管损伤n。朝向T辅助1 (Thl)细胞的促炎失 平衡可促进左心室膨胀、心脏收缩机能障碍和功能降低12。因此，AMI之后调节嗜中性粒细 胞和炎性细胞应答会帮助减少对心肌的损伤。
[0223] MultiStem?是已证明在临床前模型中，现在在阶段I临床试验中，在AMI之 后改善心肌功能的扩增的人临床级同种异体多能成体祖细胞13_15。在动物模型中通过直 接左前降动脉结扎诱导心肌梗死之后将MultiStem递送至梗死附近位点致使心脏功能改 善。与对照载体相比，这些研宄中MultiStem处理的动物显示出左心室收缩性能改善，伤 痕区域减小、血管密度增加和心肌能量特征改善14， 16，17。由于MultiStem植入水平低并且 MultiStem最低程度地分化为心肌和内皮细胞，在AMI期间MultiStem的益处被认为来自旁 分泌效应。
[0224] 先前的研宄已经证明啮齿动物和人MultiStem显示出强效的免疫抑制特性，并且 证明了MultiStem培养物在体外是非免疫原性的并且能够抑制抗体激活的T-细胞扩增 13'15。曾猜测MultiStem的免疫抑制或抗炎特性扩展至内皮细胞，并且MultiStem可在AMI 期间部分地通过内皮细胞活化和免疫细胞黏附的免疫调节而提供益处，所述内皮细胞活化 和免疫细胞黏附的免疫调节导致嗜中性粒细胞浸润减少。
[0225] 在该研宄中，通过检测细胞粘附分子在细胞表面上是否下调来检测MultiStem以 确定它是否能够调节内皮细胞活化。发现将MultiStem与主动脉或肺部的上皮细胞共培养 可以防止用TNF-a活化后内皮细胞的细胞表面上E-选择蛋白、V-CAM和I-CAM的上调，其 中对I-CAM上调的防止作用程度较低。E-选择蛋白的上调看起来并不是因为从细胞表面 切割的增加。相反，MultiStem通过降低V-CAM、I-CAM和E-选择蛋白的转录而调节细胞表 面上调。与未处理对照相比，在与MultiStem共培养时出现的细胞表面黏着分子表达的减 少可导致结合至内皮细胞的嗜中性粒细胞减少。该活性并不是骨髓衍生的黏着干细胞所共 有的，因为MSC不能够调节用TNF-a活化后V-CAM、E-选择蛋白或I-CAM细胞表面上调。 这些结果表明MSC和MultiStem响应炎性信号具有不同的分泌谱。为了确定降低的内皮细 胞活化是否能够减少急性心肌梗死之后的炎症和嗜中性粒细胞浸润，在AMI大鼠模型中检 测了MultiStem对减少由缺血事件诱导的炎性应答的作用。发现嗜中性粒细胞浸润水平降 低，与以下现象一致：永久性LAD结扎之后，与运载体对照相比，在MultiStem处理的心脏中 嗜中性粒细胞组织弹性蛋白酶水平下降。
[0226] 材料和方法
[0227] 细朐培养
[0228]从Lonza(Walkersville,MD,http://www.lonza.Com)购买了人主动脉内皮细 胞（HAEC)，并且根据制造商的说明书培养以传代7次，使用来自Lonza的内皮生长培养 基-2 (EGM-2)。从ScienCe11 (Carlsbad,CA,www.sciencellonline.com)购买了人肺微动脉 内皮细胞（HPMEC)并且根据制造商的说明书培养以传代4次，使用来自ScienCell的内皮 细胞培养基（ECM)。从Lonza购买了人间充质干细胞（MSC)并且根据制造商的说明书培养 以传代6次，使用来自Lonza的间充质干细胞生长培养基（MSCGM)。如参考文献所述培养人 MultiStem18。
[0229] 内皮共培养测定
[0230] 在加湿、5 % 0)2和37 °C的环境下，将HAEC或HPMEC使用各自的培养 基以IX105个细胞/cm2铺板于 6 孔 0.4ym膜Transwell板（ThermoFisher Scientific,Waltham,MA,http: //www.fishersci.com)的底部，孵育 3 天。吸去培养基，用 PBS清洗所述细胞。每孔加入2ml的MultiStein?培养基，添入物包含1:1、1:4、1:10或 1:20 (HAEC:MultiStem)。将lml的MultiStem培养基中的MultiStem置于所述孔中。向每 孔加入来自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO,http://www.sigmaaldrich.com)的lOng/ml重 组人肿瘤坏死因子a(rhTNFa)。还设置仅由内皮细胞（-rhTNFa)组成的对照、由单独的 内皮细胞+l〇ng/mlrhTNFa组成的对照和1:1共培养物（-rhTNFa)对照。对照是在3ml MultiStem培养基中制备的。然后在加湿、5%C0JP37°C的环境中培养所述样本。或者， 对于对照研宄，可以使用MSC和MSCGM代替MultiStem和MultiStem培养基。还可以使用 来自Sigma-Aldrich的10ng/ml的重组人白细胞介素113 (rhIL-113 )代替rhTNFa来进行 所述测定。
[0231] 流式细朐术分析
[0232]使用 50/50PBS/EnzymeFree(Millipore，Billerica,MA，http://www.millipore. com)将细胞从所述6孔板中分离出来，在1600rpm旋转5分钟沉底，重悬浮于600y1 的PBS。将每个样本等分至3管用于流式细胞术染色。在黑暗中将所述细胞与来自BD Pharmingen(SanJose,CA,http://www.bdbiosciences.com)的 20yl的针对CD106FITC 缀合的（V-CAM1)的抗体、针对CD54PE缀合的（I-CAM1)的抗体或针对CD62EPE缀合的 (E-选择蛋白）的抗体在4°C孵育40分钟。此外，使用FITC小鼠IgGlK或PE小鼠IgGlK(BD Pharmingen)进行同种型对照。将所述细胞用2ml的PBS清洗，在1600rpm旋转5分钟沉 底。弃去上清液，将所述细胞重悬浮于200yl的PBS+1%多聚甲醛（ElectronMicroscopy Sciences.Hatfield.PA.http: //www.electronmicroscopysciences.com)中。在装配有 488-nm氩激光的FACSVantageSE流式细胞仪（BectonDickinsonImmunocytometry Systems,SanJose,California)上进行流式细胞术分析。使用585/42带通滤波器检测来 自PE(FL2)荧光的发射。使用CellQuest?软件（BectonDickinson)进行数据获取和分 析。
[0233] 免痔荧光
[0234] 在为所述共培养测定对HAEC铺板之前，将12mm的显微镜盖玻片（Fisher Scientific)放置在6孔Transwell板的底部。在室温下用10 %驴血清（Jackson ImmunoResearchLaboratories,WestGrove,PA,http://www.iacksonimmuno.com) 封闭所述细胞1小时，之后在4°C下用人E-选择蛋白的小鼠单克隆抗体（SantaCruz Biotechnology,SantaCruz,CA,http://www.scbt.com)的 1:50 稀释物孵育过夜，伴随着 缓慢搅动。然后用PBS-T清洗所述细胞4次，每次5分钟，之后在室温下用小鼠AlexaFluor 488 的驴抗体（Invitrogen,Carlsbad,CA，http://www.invitrogen.com)的 1:400 稀释物 孵育1小时。然后用PBS-T将这些细胞洗涤4次，每次5分钟。使用Leica显微镜（Leica ，Microsystems,Bannockburn,IL,http://www.leica-microsystems.com)、0ptronics相机 和Magnafire软件(Optronics,Goleta,CA,http: //www.optronics.com)在 100X放大率 下获取图像。
[0235]ELISA
[0236] 在所述共培养试验后收集所述培养基，并将2倍稀释的样本根据制造商的说 明书用于可溶性 E-选择蛋白的 ELISA (R&DSystems, Minneapolis, MN, http: //www. rndsvstems. com)〇
[0237] RT-PCR
[0238] 使用0.25%胰蛋白酶-￡01六(1]1￥；[1：1'08611)将细胞从所述6孔1'四118￥611板中分 离出来，离心并重悬浮于1.8ml裂解缓冲液中。使用AbsolutelyRNAMiniprep试剂盒 (Stratagene,LaJolla,CA,http://www.stratagene.com)根据制造商的说明书提取RNA。 在65yl提供的洗提缓冲液中洗提所述RNA。使用lOOpmolRandomPrimers(Promega,Mad ison,WI,http://www.promega.com)进行RT-PCR。在 96 孔板上检测RT阳性和RT阴性以 及水。
[0239] 嗜中件粒细朐结合测宙
[0240] 从健康志愿者的外周血中分离嗜中性粒细胞。分离之后，通过在37°C加入 LPS(0. 1yg/ml) 10分钟使嗜中性趁细胞活化10分钟。在TNF-a存在或不存在的条件下， 如上文所述将HAEC与MultiStem或MSC孵育72小时。然后除去培养基，清洗所述细胞，然 后将内皮细胞与活化的嗜中性趑细胞孵育1分钟。然后将所述内皮细胞用PBS清洗4次以 除去所有未结合的嗜中性趁细胞。多次清洗之后，通过显微镜（20X物镜）检查与内皮细 胞结合的嗜中性趁细胞，并且拍照。对每个视野中与内皮层结合嗜中性趁细胞计数。每种 情况重复3次，每孔拍照3个视野。
[0241] 动物研究
[0242] 细胞制备一一在细胞注射的每一天，将MultiStem解冻并测试生存力。将显示 >90%生存力的细胞以5千万个细胞/mL重悬浮于PBS。先前的解冻实验表明MultiStem细 胞在这些条件下保持>95%的活性最长达8小时。
[0243] 动物手术--本研宄描述的所有实验动物方法都是根据AnimalResearch CommitteeoftheClevelandClinicFoundation(Cleveland,Ohio,USA)提供的方案进 行的。体重为150_175g的雄性Lewis大鼠被通过腹膜内注射氯胺酮（ketamine) (100mg/ kg)和甲苯噻嘆（xylazine) (5mg/kg)的混合物麻醉，并在80次呼吸/min下用室内气体换 气（RSP1002,KentScientificCorp，Torrington，CT)。在 25 只大鼠中通过胸骨切开术 和手术结扎左前降动脉来诱导前壁心肌梗死。通过所述缝合远端的组织的漂白来确认LAD 的结扎。LAD结扎之后，将1千万LewisRatMultiStem细胞（5千万个细胞/ml)或单独的 PBS在梗死区域周围的区域注射进入心脏。手术后3天处死动物。将来自10只动物（5只 为运载体处理，5只为MultiStem处理）的心脏包埋在0CT中并且用于冷冻薄切片。随后将 切片对弹性蛋白酶染色（以确定嗜中性粒细胞数目）。
[0244] 统计学
[0245] 使用StudentT检验或AN0VA连同后续分析进行统计学分析，当合适时以p〈0. 05 接受为统计学显著。误差线表示为标准差。
[0246] 结果
[0247] MultiStem防止活化后细胞粘着分子上调
[0248] 当暴露于促炎细胞因子，例如TNF-a时，黏着分子在内皮细胞表面上的表达显著 增加。为了测试MultiStem是否能够调节该应答，在TNF-a存在或不存在的情况下，将 MultiStem与人主动脉内皮细胞（HAEC)在transwell中共培养3天。之后，通过FAC分析 或免疫染色测量E-选择蛋白、V-CAM和I-CAM的细胞表面表达（图1A)。72小时之后，与 未活化对照相比，TNF-a在MultiStem不存在的情况下诱导了高水平的所有3中标记物。 然而，发明人发现在存在MultiStem的情况下，具有E-选择蛋白（图IB)(p= 0. 0149)和 V-CAM(p= 0. 0037)表面表达的细胞数量显著下降（图1B)。此外，在最高剂量的MultiStem 下，I-CAM的细胞表面表达水平（p= 0. 001)下降（图1C)。MultiStem对细胞表面黏着分 子上调的调节是细胞剂量依赖的，随着MultiStem浓度的下降而降低，并且用来自其他供 体的MultiStem可以重复（未显示数据）。为了检查该效应是否是TNF-a特异的，使用白 细胞介素1 0 (11-1 0 )重复该实验。与使用TNF-a的结果类似，当用11-1 0活化时，与对 照相比，与MultiStem共培养抑制了黏着分子（E-选择蛋白、V-CAM和I-CAM)在细胞表面 的上调（图2B)。
[0249] 接着，检测在Mu11iStem存在下细胞粘附分子的表面表达的下调是否是主动脉内 皮特异的应答，或者其他内皮细胞系是否也以类似的方式响应MultiStem。测试了人肺微 血管内皮细胞（HPMEC)以确定这些细胞对MultiStem响应是否以类似于HAEC的方式下调 TNF-a诱导的细胞粘附分子细胞表面表达（图2A)。在细胞表面表达TNF-a诱导的E-选 择蛋白（P〈〇. 0001)和V-CAM(p〈0. 0001)的HPMEC的数量在与MultiStem共培养之后下降。 类似地，在与最高剂量MultiStem共培养的细胞中I-CAM细胞表面表达也显著下降（p= 0. 028)(图2A)。因为这些实验是在transwell中进行的，MultiStem调节内皮细胞黏着标 记物活化并不需要MultiStem和内皮细胞之间的直接相互作用。因此，这些数据表明，从 MultiStem分泌的可溶因子是以旁分泌的方式作用来减少内皮细胞表面黏着分子表达。
[0250] MultiStem不增加黏着分子的脱落而是通讨防lh黏着分子RNA表汰诱导来起作用
[0251] MultiStem能够降低黏着分子（例如E-选择蛋白）细胞表面表达的一种可能机 制是增加这些分子从细胞表面切割。黏着分子从细胞表面切割是由不同的蛋白酶（包括金 属蛋白酶，例如TACE/ADAM17)介导的。之前的研宄表明，可溶黏着分子可能是病理性的并 且可以促进嗜中性粒细胞活化19' 2°。对用MultiStem的处理进行检查以确定它是否通过增 加E-选择蛋白表面脱落而降低E-选择蛋白表面表达。在MultiStem存在或不存在的情况 下，通过ELISA测量了由内皮细胞分泌到条件化培养基中的可溶E-选择蛋白的水平。在 从MultiStem和HAEC或HPMECS共培养物中收集的条件化培养基中没有发现sE-选择蛋 白浓度增加（图3A，未显示数据）。相反地，发现在以最高比例与MultiStem的共培养的 TNF-a活化的HAEC(p〈0. 001)和HPMEC(p〈0. 001)的培养基中可溶E-选择蛋白出现下降， 表明E-选择蛋白的表面表达下降是表面表达的下降连同之后的可溶E-选择蛋白的脱落减 少的结果（图3A)。因此，E-选择蛋白的表面表达降低不是因为该分子从细胞表面的切割 增加，说明内皮细胞表面的细胞粘附分子的减少不是这些分子蛋白水解切割的结果。
[0252] 由于当用例如TNF-a的促炎细胞因子处理内皮细胞时，其中的细胞表面黏着分 子E-选择蛋白、V-CAM和I-CAM均转录活化，测定MultiStem是否能够在转录水平调节这 些黏着分子的调节（图3)。内皮细胞（HAECS)在存在或不存在TNF-a下与MultiStem孵 育72小时。随后从所述内皮细胞分离RNA并反转录成cDNA。使用针对E-选择蛋白、V-CAM 和I-CAM和GAPDH的引物进行定量PCR。mRNA的表达水平被相对GAPDH水平标准化（图 3B)。这些结果表明E-选择蛋白、V-CAM和I-CAMmRNA水平在MultiStem存在下下降，表 明MultiStem可抑制这些基因的TNF-a上调。类似的结果可见于当MultiStem与肺内皮 细胞（HPMEC，未显示数据）共培养时。由TNF-a引起的V-CAM、I-CAM和E-选择蛋白转录 活化是NFkB依赖的，表明MultiStem在一定程度上调节NFkB信号传递。
[0253] 不同于MultiStem, MSC不显著调节细胞粘附分子表达
[0254] 其他骨髓源干细胞也已被证明通过在动物模型中防止T细胞增殖、抑制天然杀伤 细胞功能以及调节免疫疾病（例如克罗恩病和GVHD)而调节免疫功能。为了评估MultiStem 对内皮细胞活化的免疫调节作用是否也可由其他干细胞系产生，在TNF-a存在下将内皮 细胞与MSC共培养72小时，之后检查细胞粘附分子的细胞表面表达。令人惊讶的是，与 未处理对照相比，在MSC存在下TNF-a诱导的内皮细胞粘附分子表面表达没有变化，而 MultiStem显著减少黏着分子表达（图4A-C)。对于MSC在最高剂量观察到了E-选择蛋白 表面表达的微弱减少，然而，该变化显著小于在MultiStem存在下可见的变化（图4A)。因 此，MSC不调节TNF-a引起的黏着分子上调。这些结果证明MultiStem具有与MSC在功能 上不同的分泌谱，其表现在它们的生物学活性的差异上。
[0255] 活化的内皮细朐与MultiStem共培养防lh嗜中件粒细朐结合
[0256] 已经证明内皮细胞细胞表面上细胞粘附分子的上调对于例如嗜中性粒细胞的免 疫细胞的滚动和牢固黏着是关键的 4。为了确定由MultiStem引起的对黏着分子在细胞 表面的上调的调节是否足以影响嗜中性趁细胞结合至内皮细胞，比较了嗜中性趁细胞对 MultiStem处理的内皮细胞和未处理内皮细胞的结合。将内皮细胞培养至汇合单层，在 MultiStem存在或不存在的情况下用TNF-a处理72小时。从至少2个不同的供体分离嗜 中性趑细胞，通过加入LPS(0. 1yg/ml)活化，并且与内皮细胞孵育1分钟。多次清洗之后， 通过显微镜（10X物镜）检查内皮细胞和嗜中性趁细胞的结合并拍照。对每个视野中与 内皮细胞结合的嗜中性趑细胞计数（图5A)。仅低水平的活化或未活化的嗜中性趁细胞结 合至未活化的内皮细胞。然而，当用TNF-a活化后，如所预期，在结合的嗜中性趁细胞中 可见显著增加（图5B)。当内皮细胞与MultiStem预孵育时，嗜中性趁细胞结合显著降低 (p〈0. 0001)。这些结果证明内皮细胞上黏着分子表达的变化足以改变内皮细胞层对嗜中性 趑细胞的结合特性。相反，在TNF-a活化期间，将MSC与内皮细胞共培养不能改变嗜中性 趑细胞结合。此外，当单独的或者与MSC共培养的TNF-a活化的内皮细胞暴露于嗜中性趁 细胞时，内皮细胞形态会发生显著改变，成为更长更细的细胞型，并且细胞-细胞接触减少 (图5C)。与MultiStem共培养的内皮细胞当用TNF-a活化后，细胞形态的没有多大变化， 并且保持着细胞-细胞接触。这些数据表明MultiStem从功能上改变活化的内皮细胞。因 此，检测MultiStem以确定它是否能够在体内影响内皮细胞迀移。
[0257] 用MultiStem处理减小LAD-诱导的急件心肌挿死之后的嗜中件粒细朐浸润
[0258] 先前的动物研宄已经证明在心肌梗死（由直接左前降支结扎诱导）之后将 MultiStem直接注射进入梗死附近部位导致心脏功能改善14'16。该报道中的所述结果证明 MultiStem能够下调TNF-a存在下黏着分子（E-选择蛋白、V-CAM和I-CAM)的细胞表面表 达。这些分子对于嗜中性趁细胞黏着和通过内皮外渗是关键的。由于缺血之后嗜中性趁细 胞浸润进入心脏可能是有害的并且可导致缺血损伤之后心脏功能下降 1(U1，猜测MultiStem 处理之后心脏功能的改善部分地是由于AMI之后炎症减少和嗜中性白趁细胞浸润进入梗 死区域附近。为了验证该假设，在大鼠中诱导心肌梗死之后检查存在于心脏中的嗜中性粒 细胞水平。
[0259] 在大鼠中通过结扎左前降动脉（LAD结扎）诱导前壁心肌梗死。LAD结扎之后，将