来自海洋的芽孢杆菌ze01及其产低温淀粉酶的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种微生物，特别是一种分离自中国江苏省连云港海域海泥的芽孢 杆菌sp. )ZE01;本发明还涉及该菌株产低温淀粉酶的方法。
【背景技术】
[0002] a_淀粉酶（EC3. 2. 1. 1)是指一类作用于淀粉分子，从分子内部切开a_1，4糖苷 键，生成糊精和还原糖的水解酶，产物末端葡萄糖残基C1碳原子为a_构型，故称a_淀粉 酶。淀粉酶广泛应用于食品、医药、洗涤、造纸、纺织及皮革等领域。低温淀粉酶一般来源 于低温微生物，通常情况下，在相对较低温度范围内，低温淀粉酶的活性比相应的嗜温淀粉 酶要高。目前研宄的淀粉酶主要是中高温淀粉酶，这些酶只有在较高温度下才具有较好的 催化活性，因而耗费能量巨大，如果采用低温淀粉酶则可以节约能量，降低生产成本，符合 我国国情，研宄前景广阔，逐渐成为人们研宄开发的热点。因此从海洋环境中筛选高产低温 a_淀粉酶的菌株，是今后研宄和开发低温淀粉酶的关键。
【发明内容】
[0003] 本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种新的能产低温淀粉 酶的来自海洋的芽孢杆菌ZE01。
[0004] 本发明所要解决的另一个技术问题是提供上述芽孢杆菌ZE01产低温淀粉酶的方 法。
[0005]本发明的特征包括来自海洋的芽孢杆菌sp. )ZE01菌株本身（以下称菌 株ZE01)，以及利用该菌株发酵生产低温淀粉酶的方法。
[0006] 本发明所涉及的菌株ZE01是在中国江苏省连云港海域的海泥中分离到的芽孢杆 菌sp. )ZE01，该菌株已于2015年1月20日保藏在中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为CGMCCN0. 10375。保藏单位地址：北京市朝阳区北 辰西路1号院3号中国科学院微生物研宄所，联系电话：010_64807355。
[0007] 以下对本发明进行详细的阐述。
[0008] 一、本发明菌株ZE01的形态特征与生理生化特征。
[0009] 1. 1形态特征： 菌株ZE01为革兰氏阳性芽孢杆菌（见图1);在2216E固体培养基中培养24h后，菌落 呈乳白色，表面干燥，有皱褶。在淀粉筛选培养基培养48h后，加碘液后能产生明显的透明 圈（见图2)。
[0010] 1.2生理生化特征： 该菌株VP、明胶酶实验、葡萄糖氧化实验呈阳性，e-半乳糖苷酶、精氨酸双水解酶、赖 氨酸脱羧酶鸟氨酸脱羧酶、色氨酸脱氨酶、脲酶实验呈阴性，不利用柠檬酸，不产生硫化氢 和吲哚，不利用蔗糖、阿拉伯糖、鼠李糖、蜜二糖、甘露醇、肌醇、山梨醇、苦杏仁苷，生理生化 结果见表1。
[0011] 表1菌株ZE01的生理生化特征
注：+:阳性；-:阴性 1. 3菌株ZE01的序列的扩增和分析： 用Generay试剂盒提取得到ZE01的基因组，选用扩增原核微生物16SrDNA序列的通用 引物（27F:5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和 1492R: 5' -GGTTACCTTGTTACGACTT-3'） 于PCRmix体系中反应。反应体系：PCRmix(46yL)，上下游引物（各lyL)，DNA模板 (2yL)。反应程序：94°C变性 5min; 94°C变性 30S，54°C退火 30S，72°C延伸 90S， 32个循环；72°C10min。将PCR电泳纯化回收并构建克隆载体，选阳性克隆子提取质粒 送至南京思普金生物科技有限公司测序，将测得序列互补反相拼接后，获得的1262bp碱基 片段序列，用MEGA5软件进行16SrDNA序列的比对分析，并构建系统发育树(如图3)，将该 序列与GenBank数据库中的序列进行同源性比对，结果发现与芽孢杆菌属最接 近。
[0012] 二、本发明菌株ZE01的生长特性 本发明提供的菌株ZE01，对其生长特性进行了细致的研宄，基本摸清不同条件下该菌 的生长情况。
[0013] 2. 1本发明中涉及的培养基： 2216E培养基：蛋白胨0. 5%，酵母粉0. 1%，陈海水配制，pH8 ; 淀粉筛选培养基：蛋白胨1%，牛肉膏〇. 5%，可溶性淀粉0. 2%，陈海水配制，pH8. 0 ; 产酶培养基：甘油〇. 5%，玉米淀粉0. 5%氯化铵0. 5%，NaCl0. 5%，pH7. 0。
[0014] 2. 2种子液的制备：将菌株ZE01斜面种子接种到2216E培养基中，30°C，180r/ min,装液量20%，培养16h。
[0015] 2. 3培养时间对菌株ZE01生长的影响： 将种子液2%接种至2216E培养基中，pH8. 0, 30°C，180r/min培养48h，每隔4h取一次 样，于〇D595下测定其菌浓度。菌株8h进入对数期，在24h进入稳定期，见图4。
[0016] 2. 4温度对菌株ZE01生长的影响： 分别在不同温度下培养24h，其余条件同2.3,测定0D值。该菌株生长温度范围为 15-45°C，最适生长温度为30°C，见图5。
[0017] 2. 5培养基pH对菌株ZE01生长的影响： 培养基pH范围5. 0-10.0，最适温度培养，其余条件同2. 3。生长pH范围为5. 0-9.0， 最适生长pH为6.0,见图6。
[0018] 2. 6NaCl浓度对菌株ZE01生长的影响： 培养基用自来水配制，NaCl浓度为0%-8%，在最适温度和pH下培养，其余条件同 2. 3,菌株在NaCl浓度为0%-8%范围内能生长，最适生长的NaCl浓度为0. 5%，见图7。
[0019] 三、菌株ZE01发酵生产低温淀粉酶的方法 发明人对菌株ZE01发酵生产低温淀粉酶的方法进行了研宄。
[0020] 3. 1培养时间对菌株ZE01产酶影响： 将种子液以2%的接种量接种至2216E液体培养基内，30°C、180r/min摇床培养48h，每 隔4h取一次样，测定酶活力。产酶时间为28h时间，产酶量达最高，见图8。
[0021] 3. 2温度对菌株ZE01产酶影响： 菌株ZE01在不同温度（15°C、20°C、25°C、30°C、35°C)下培养28h，其余条件同3. 1，分 别测酶液的活力，最佳产酶温度为25°C，结果见图9。
[0022] 3. 3培养基pH对菌株ZE01产酶的影响： 将2216E液体培养基的pH调节至5. 0-10. 0。在25°C、180r/min下振荡培养24h， 测酶活，该菌株在PH5. 0-8. 0范围内产酶良好，最适产酶pH为7. 0,见图10。
[0023] 3. 4NaCl浓度对菌株ZE01产酶的影响： 培养基用自来水配制，NaCl浓度0%-8%，在最适温度和pH下培养，其余条件同3. 3， 测酶活，该菌株在NaCl浓度0%-6%产酶较好，最适产酶NaCl浓度为0. 5%，见图11。
[0024] 3. 5碳氮源对菌株ZE01产酶的影响： 0. 5%的碳源(酵母粉，糊精，马铃薯淀粉，玉米淀粉，山芋淀粉，绿豆淀粉，乳糖，葡萄糖， 蔗糖，淀粉糖，麦芽糖，麸皮，甘油）和氮源(硫酸铵，氯化铵，豆柏粉，鱼粉蛋白胨，胰蛋白胨， 干酪素，鱼粉，花生柏，尿素）分别用于替换培养基中的酵母膏和蛋白胨，接种后在在30°C、 180r/min下振荡培养24h，分别测酶液的活力。结果发现，甘油和玉米淀粉作为培养基碳 源可促进产低温淀粉酶，而胰蛋白胨和氯化铵作为氮源时对产酶有促进作用，见图12-13。
[0025] 3.6低温淀粉酶活测定： 将50yL酶液加入到150yL1%的可溶性淀粉Tris-HCl缓冲液（50mmol/L，pH8. 0) 中，在30°C水浴中反应15 min，用DNS法测定还原糖量。酶活力单位定义（U/mL):在一定 温度和pH下，每分钟催化产lumoL还原糖的酶量为一个活力单位。
[0026] 与现有技术相比，本发明提供了一种新的芽孢杆菌)ZE01，该菌株可 以产低温淀粉酶，所产酶性质稳定，酶活性好，可以用于现有技术常规低温淀粉酶的应用场 合，包括食品行业、饲料行业和环境治理行业。
【附图说明】
[0027] 图1为菌株ZE01扫描电镜照片形态（X10 000)图； 图2为菌株ZE01在淀粉平板上形成的透明圈图； 图3为菌株ZE01系统进化树； 图4为时间对菌株ZE01生长的影响； 图5为温度对菌株ZE01生长的影响； 图6为pH对菌株ZE01生长的影响图； 图7为NaCl浓度对菌株ZE01生长的影响图； 图8为时间对菌株ZE01发酵产酶的影响图； 图9为温度对菌株ZE01发酵产酶的影响图； 图10为pH对菌株ZE01发酵产酶的影响图； 图11为NaCl浓度对菌株ZE01发酵产酶的影响图； 图12为不同碳源对菌株ZE01发酵产酶的影响图； 图13为不同氮源对菌株ZE01发酵产酶的影响图。
【具体实施方式】
[0028] 以下进一步描述本发明的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进一步地理解 本发明，而不构成对其权利的限制。
[0029] 实施例1，一种来自海洋的芽孢杆菌sp. )ZE01，CGMCC N0. 10375。该 菌株具有以下特征：菌株ZE〇l为革兰氏阳性芽孢杆菌，在含淀粉的培养基上的菌落特征为 乳白色，表面干燥，有皱褶，边缘整齐，淀粉平板加碘液后能产生明显的透明圈。VP、明胶酶 实验、葡萄糖氧化实验呈阳性，0 _半乳糖苷酶、精氨酸双水解酶、赖氨酸脱羧酶鸟氨酸脱羧 酶、色氨酸脱氨酶、脲酶实验呈阴性，不利用柠檬酸，不产生硫化氢和吲哚，不利用蔗糖、阿 拉伯糖、鼠李糖、蜜二糖、甘露醇、肌醇、山梨醇、苦杏仁苷。菌株ZE01生长特性为：该菌株生 长温度范围为15-45°C，最适生长温度为30°C;生长pH范围为5-9,最适生长pH为6. 0 ;菌 株在NaCl浓度为0%-8%范围内能生长，最适生长的NaCl浓度为0. 5%。
[0030] 实施例2, 一种如实施例1所述的来自海洋的芽孢杆菌ZE01产低温淀粉酶的方法， 其步骤如下：将芽孢杆菌ZE01接种到2216E培养基中，转速180r/min，装液量20%，30°C培 养12h，得种子液；将种子液以2%的接种量接种于产酶培养基中，180r/min，30°C培养28h， lOOOOr/min离心5min，取上清液即为低温淀粉酶粗酶；所述的产酶培养基的组成为：甘油 0? 5%，玉米淀粉 0? 5%，氯化铵 0? 5%，NaCl0? 5%，pH7. 0。
【主权项】
1. 一种来自海洋的芽孢杆菌（sp. ) ZE01，其特征在于：其保藏号为CGMCC NO. 10375 〇2. -种如权利要求1所述的来自海洋的芽孢杆菌（sp. )ZEOl产低温淀粉酶 的方法，其特征在于，其步骤如下：将芽孢杆菌)ZE01接种到2216E培养基中， 转速180r/min，装液量20%，30°C培养12h，得种子液；将种子液以2%的接种量接种于产酶 培养基中，180r/min，30°C培养28h，10000r/min离心5min，取上清液即为低温淀粉酶粗酶； 所述的产酶培养基的组成为：甘油〇. 5%，玉米淀粉0. 5%氯化铵0. 5%，NaCl 0. 5%，pH 7. 0。
【专利摘要】本发明是一种芽孢杆菌（Bacillus sp.）ZE01，CGMCC N0.10375。该菌株为革兰氏阳性芽孢杆菌；菌落为乳白色，表面干燥，有皱褶，边缘整齐。VP、明胶酶实验、葡萄糖氧化实验呈阳性，β-半乳糖苷酶、精氨酸双水解酶、赖氨酸脱羧酶鸟氨酸脱羧酶、色氨酸脱氨酶、脲酶实验呈阴性，不利用柠檬酸，不产生硫化氢和吲哚，不利用蔗糖、阿拉伯糖、鼠李糖、蜜二糖、甘露醇、肌醇、山梨醇、苦杏仁苷。该菌株生长温度范围为15-45℃，菌株生长pH范围为5-9；菌株生长NaCl浓度范围是0%-8%。本发明还公开了一种利用菌株ZE01产低温淀粉酶的方法。该低温淀粉酶在饲料、环保等领域具有广泛的应用前景。CGMCC N0.1037520150120
【IPC分类】C12R1/07, C12N1/20, C12N9/28
【公开号】CN104962503
【申请号】CN201510436666
【发明人】王淑军, 吕明生, 田径, 王小贝, 房耀维, 刘姝
【申请人】淮海工学院, 连云港杰瑞自动化有限公司
【公开日】2015年10月7日
【申请日】2015年7月23日