接种(将菌丝面朝下)到新的PDA半固体平板的中央，再均匀在培养皿中空白处放入5-20粒无菌油菜籽(水霉菌诱饵)；扣上皿盖后将平板倒置(皿底在上，皿盖在下防止培养基水分蒸发)放入20-25?恒温培养恒温继续培养，待油菜籽上覆盖菌丝后将其取出并置于无菌水的6孔板中，于20-25°C培养直至游动孢子释放。无菌吸取100 μ I孢子悬液至PDA半固体平板上均匀涂布，20-25?恒温培养并切取单菌落琼脂块到PDA半固体平板上进行纯化培养。提纯后的水霉菌株可置于4°C保存。
[0032]3、水霉(菌丝、孢子)伊文思蓝活体快速染色观察
[0033]快速判断水霉菌(孢子与菌丝)活性，是科研工作者十分关心的问题。常规的方法是通过活体培养的方法来鉴定，这种方法可靠，但是耗时长(少则几h，多则l-5d)，经常会殆误最佳防治时机，给水产动物养殖者带来经济损失。在动、植物实验中经常用中性红，台盼蓝对细胞染色来快速判断细胞的活力情况(如王珂，梁文艳，王金丽.铜绿微囊藻中性红染色研宄.环境科学与技术)；而在水霉活体快速染色观察则鲜见报道；为此本发明做了大量的活体染色剂的筛选实验，最后确定了 “水霉菌伊文思蓝活体染色法”:取少量的水霉菌(孢子与菌丝)，用2-5%。伊文思蓝染色液浸染Ι-lOmin，然后用显微镜观察，水霉菌(孢子与菌丝)有活性时不着色，无活性时着蓝色。
[0034]伊文思蓝，中文名:偶氮蓝，6，6’-[[3，3’-二甲基(1，I’-二苯基)_4，4’-二基]双(偶氮基)]双(4-氨基-5-羟基-1，3-萘二磺酸)四钠盐，分子式C34H24N6NA4014S，水溶性 280g/l(20°C ) ο
[0035]伊文思蓝常用于检测细胞膜完整性和细胞是否存活。活细胞因有外排功能而无法被伊文思蓝染色，而死细胞则会被染成淡蓝色，因此可以通过此方法在显微镜下区分死细胞与活细胞，但无法区分死亡与坏死。
[0036]本发明的有益效果:
[0037]1、首次提出了水霉孢子与菌丝的伊文思蓝活体染色法:有活力的水霉孢子与菌丝均不着色，无活力的水霉孢子与菌丝着蓝色；故显微镜检时只要看孢子与菌丝是否着蓝色便能知道孢子与菌丝的活力情况。
[0038]2、根据未着色细胞占整体细胞的比例，可计算出活细胞的百分率；死细胞百分率(% ) = 100 一活细胞百分率。
[0039]3、伊文思蓝法判定水霉(菌丝与孢子)活力情况，所需时间短；仅需Ι-lOmin.
[0040]总之，本发明具有简单、易行、快速、直观等特点；适用于科研院所、学校、技术推广站及水产养殖公司。
【具体实施方式】
[0041 ] 下面通过具体实施例来进一步说明。
[0042]实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的范围；此外应理解为:在阅读本发明所叙述之后，本领域的技术人员可能对本发明作各种改动与修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限制的范围。
[0043]实施例1:
[0044]HGSMOl水霉株:2013年4月分离自安徽滁州市水产良种场黄金鲫卵生水霉，2013年10月将生物样品寄达上海海洋大学(国家水生动植物病原库)进行菌株分子生物学鉴定后确认为多子水霉。
[0045]取生长在在水霉半固体平板中的油菜籽诱饵(长满有水霉菌丝)与刚刚释放出的水霉孢子(具体参考水霉菌提纯操作)，分为2组，每组6个平行。一组用80°C水浴1min (试验组)，另一组不作处理(参照组)，每组取3个平行然后加入2%。伊文思蓝水溶液浸染2min后显微镜检，试验组水霉(菌丝与孢子)全部被染成淡蓝色，参照组均为无色；将试验组与参照组的水霉材料(另3个平行)分别接种到PDA半固体培养基培养24、48h后观察，培养结果显示:试验组均没有菌丝生长；参照组均有菌丝生长。
【主权项】
1.水霉伊文思蓝活体染色方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)从水生动物体表取少量含水霉菌丝的组织或带有水霉菌的卵在75%的酒精中浸泡2-3min,用无菌水冲洗数次后置于PDA链霉素半固体平板中央，平板倒置，在20_25°C条件下培养； (2)切取步骤(I)平板中菌落边缘的菌丝块，在75%的酒精中浸泡2-5seC，用无菌水冲选后将菌丝面朝下反接种到新的PDA半固体平板的中央，均匀在平板空白处放入水霉菌诱饵；半固体将平板倒置放入20-25?恒温培养恒温继续培养，待诱饵上覆盖菌丝后将其取出并置于无菌水的6孔板中，于20-25°C培养直至游动孢子释放；吸取100 μ L孢子悬液至PDA半固体平板上均匀涂布，20-25?恒温培养并切取单菌落琼脂块到PDA半固体平板上进行纯化培养；提纯后的水霉菌株可置于4°C保存； (3)用2-5%。的伊文思蓝染液，浸染水霉菌丝、孢子Ι-lOmin，然后显微镜检观察，着蓝色者为死细胞；不着色者为活细胞； (4)根据未着色细胞占整体细胞的比例，可计算出活细胞的百分率；死细胞百分率(% ) = 100 一活细胞百分率。2.根据权利要求1所述水霉伊文思蓝活体染色方法，其特征在于，步骤(I)中所述PDA链霉素平板的制备方法为:①配制PDA半固体培养基，配方如下:马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂条6g或琼脂粉4g，自来水100ml ;②将PDA半固体培养基溶化后，冷却至45_60°C，注Λ 200mg/l的链霉素，制成平板。3.根据权利要求1所述水霉伊文思蓝活体染色方法，其特征在于，伊文思蓝染液配制方法:伊文思蓝2-5g，用无菌水定容至1000ml。
【专利摘要】本发明公开水霉伊文思蓝活体染色方法，包括水霉株的分离、提纯培养、水霉孢子的获取，伊文思蓝染液的配制，染色方法等步骤，只要显微镜检染色后的水霉菌丝与孢子是否着蓝色，就可快速判定水霉菌丝的活力情况，通过细胞是否着色数量占整体细胞的百分比，就可简易计算出活细胞与死细胞的百分率。本发明具有简单、易行、快速、直观等特点；适用于科研院所、学校、技术推广站及水产养殖公司。
【IPC分类】C12Q1/06, C12R1/645
【公开号】CN104988204
【申请号】CN201510402065
【发明人】周呈祥, 叶伟武, 同现鹏, 张繁荣, 仲崇艳, 凌武海, 夏文伟
【申请人】杭州银江环保科技有限公司
【公开日】2015年10月21日
【申请日】2015年7月7日