具有内部名称103及BlO和B12的馏分的质 谱；
[0035] 图8-7描绘了从700-1000Amu扫描，具有与苔藓抑素-3相关的内部名称105及 B12和B14的馏分的质谱；
[0036] 图9描绘了第一苔藓素组合物和第二苔藓素组合物的紫外光谱；
[0037] 图10描绘了IO-9M的苔藓抑素-1和不同苔藓素对SHSY-5Y神经母细胞瘤细胞中 a_分泌酶活性的影响；
[0038] 图11描绘了IO-9M的苔藓抑素-1和不同苔藓素对SHSY-5Y神经母细胞瘤细胞中 PKC-e活性的影响；
[0039] 图12描绘了IO-9M的苔藓抑素-1和不同苔藓素对SHSY-5Y神经母细胞瘤细胞中 PKC-S活性的影响；
[0040] 图13描绘了IO-9M的苔藓抑素-1和不同苔藓素对SHSY-5Y神经母细胞瘤细胞中 PKC-a活性的影响；
[0041] 图14描绘了第一苔藓素的拟议结构；
[0042] 图15描绘了第二苔藓素的拟议结构；
[0043] 图16描绘了苔藓抑素-3的NMR图谱；
[0044] 图17描绘了第一苔藓素的NMR图谱；及
[0045] 图18描绘了第二苔藓素的NMR图谱。
[0046] 发明详述
[0047] 现将就选自第一苔藓素组合物（有时称为B10)、第二苔藓素组合物（有时称为 B12)、第三苔藓素组合物（有时称为B14B)、第四苔藓素组合物（有时称为B14C)的苔藓素 组合物描述本发明的实施方案。本发明的这些苔藓素组合物的分子量与苔藓抑素1-20的 分子量不同，除似乎是苔藓抑素3的立体异构体的B12外。
[0048] 分馏总合草苔虫产生苔藓抑素馏分（苔藓素）并分离单独苔藓素。
[0049] HPLC分析
[0050] 使用 15cm5ymPhenomenexLunaPFP(2)柱（UPS包装L43)和每升用 50y1 85% H3PO4酸化的60 %乙腈流动相，通过HPLC分析苔藓抑素-1。流量设为I.OmL/min并且柱温 设为30°C。使用并入996型光电二极管阵列检测器的WatersMillennium系统生成色谱扫 描（图1)。在265nm下监测苔藓抑素-1，并且同时报道从195nm到345nm的等高线图。
[0051] 苔藓抑素-1牛产和表征:
[0052] 在前两个步骤中，用包括异丙醇、甲醇、乙酸乙酯和水的有机溶剂从湿总合草苔虫 中提取苔藓抑素，接着使用由己烷/亚甲基氯和乙酸乙酯/甲醇组成的流动相进行硅胶柱 层析，或可选地用SuperFluids?(有或无助溶剂的近临界和超临界流体）二氧化碳和甲醇 从经洗涤、干燥和碾磨的总合草苔虫提取并且用二氧化碳和甲醇通过SuperFluids?硅胶 柱层析部分纯化（Castor，1998, 2001)。
[0053] 第三步是在CG71聚合树脂（Rohm-Haas)上用由甲醇和水组成的流动相将苔藓抑 素-1的纯度提高至60-70%的分段层析。第四步利用使用两根半制备级HPLCC18柱（Baker Scientific，Phenomenex)，用由乙腈和水组成的流动相的分段层析法以将苔藓抑素-1纯 度提高至> 95%。第五步利用用乙腈和水的结晶法以将苔藓抑素-1纯化至> 98. 5%。
[0054] 通过紫外（UV)光谱以及高效液相层析（HPLC)保留时间与马里兰州贝塞斯达美国 国家癌症研究所（NCI)、国家卫生研究院（NIH)提供的标准保留时间，确认苔藓抑素-1产 物的同一性。还通过质谱（MS)数据以及通过元素分析、质子和碳核磁共振（NMR)、红外光 (IR)谱法、差示扫描量热法（DSC)和熔点单独确认苔藓抑素-1产物的同一性。
[0055] 苔藓抑素-1纯化至99. 64%CP
[0056] 纯化工序和结果:
[0057] 国家癌症研究所（NCI)提供的总合草苔虫的乙酸乙酯提取物（样品C_021519#7) 用作起始原材料。总共~57g的乙酸乙酯提取物溶于二氯甲烷（DCM)中并且经化验确定苔 藓抑素-1和其它苔藓素的存在。现翻到图2,描绘了总合草苔虫乙酸乙酯粗提物的HPLC色 谱图。有标签的箭头表示苔藓抑素样化合物的内部名称，包括B10、B12和苔藓抑素3 (B16) 及苔藓抑素-2 (Bryo-2)和苔藓抑素-3 (Bryo-3)。苔藓抑素-I(Bryo-I)在24. 2min时洗 脱。名称BlO是与本发明的第一苔藓素相对应的苔藓素。B14的名称将指向本发明的第三 和第四苔藓素。
[0058] 如图3所示，使用各种层析树脂从总合草苔虫乙酸乙酯粗提物纯化苔藓抑素-1。 初始步骤（步骤1和步骤2)在活性硅胶（100-200ym)上进行，并且样品随着DCM中乙酸 乙酯浓度增加而洗脱。硅胶纯化步骤用于从乙酸乙酯粗提物中去除一些有色组分，非极性 化合物（在层析操作结束时洗脱，图3)并且消除大部分B16峰。
[0059] 接下来，在AmberchromCG71上纯化含苔藓抑素-1的馏分，这样允许用酸化甲醇 和水洗脱苔藓抑素样化合物。这种树脂有助于将对环境有害的氯化溶剂的使用减到最少。CG71纯化步骤去除了在苔藓抑素-1之前洗脱的'X5'峰。也用于将就在苔藓抑素-1之前 的杂质，主要为B16减到最少。
[0060] 使用AmiconC18 40ym树脂和两根制备级C18柱（2. 5X2. 5cm，10ym柱）的组 合进行后续纯化。这个步骤允许将B12和Bryo-3与苔藓抑素-1进一步分离，尽管在苔藓 抑素-1肩部仍然存在'x5'峰。最终结晶步骤导致将苔藓抑素-1纯化至> 99%色谱纯度 (CP)，从粗提物的回收率为69 %。
[0061] HPLC监测：
[0062] 图3概述的每个纯化步骤期间，在LunaC18 (2)柱（250X4. 6mm，IOym)上监测苔 藓抑素-1。以经磷酸（ACNP)酸化的80%乙腈在恒溶剂模式下以2mL/min流量进行洗脱。 柱温设为30 °C。
[0063] 苔藓抑素样化合物（苔藓素）
[0064] 分馏总合草苔虫产生可用作苔藓抑素-1替代物的苔藓抑素馏分（苔藓素）。这些 馏分经纯化并送至LSU进行体外分析（表1)。
[0065] 表1 :通过HPLC测定的馏分中每种苔藓素的量（mg)1
[0066]
[0067] CP对应于黑体的苔藓素。
[0068] 苔藓抑素-1类似物（苔藓素）在s-APPa分泌诱导中的效力
[0069] 图4中示出了几种苔藓抑素-1类似物（苔藓素）在s-APPa分泌诱导中的效力。 除馏分D外，与苔藓抑素-1相比，其全部诱导s-APPa明显释放。苔藓抑素-1的最佳替代 馏分是对应于名称B16的类似物E，经鉴定为苔藓抑素3。生物活性按顺序为馏分E(105) >G(112)、F(106)、C(103) >A(IOl)、B(102) >D(104)。
[0070] 从初始数据看，似乎B12或B14可比苔藓抑素-1明显更具生物活性。因为大多数 馏分含两种或更多种苔藓素，所以除含有> 97. 5%CP的B16的馏分G外，难以确定哪一种 负责生物活性。本发明的第一苔藓素组合物，B10,具有明显高于苔藓抑素-1的活性，并且 提出了作为治疗剂的另一种潜在替代苔藓素。
[0071] HPLC标准化:
[0072] 现翻到图5,其描绘了 265nm下苔藓素混合物的高效液相色谱图，在总合草苔虫乙 酸乙酯粗提物中存在各种苔藓素。
[0073] 为了每种苔藓素的鉴定（根据保留时间）和后续纯化的目的，标准化苔藓素（B09、 810、812、814(：、8148、816、苔藓抑素-1、苔藓抑素-2和苔藓抑素-3)的混合物。图6中描 绘了叙述高效液相色谱纯化结果的色谱图。如描绘265nm下不同苔藓素的紫外光谱的图7 所述，这些苔藓素含有与苔藓抑素-1类似的紫外图谱，最大波长为265nm。
[0074] 在UV-HPLC和LC/MS/MS上使用已知标准和/或与文献中的已知质量比较，尝试对 每种苔藓素的鉴定。这很重要，因为先前的初步体外实验（上述）已经证实，这些苔藓素可 能以与对苔藓抑素-1所观察到的相等或甚至更高的百分比诱导s-APPa分泌。