l探针的序列结构为NH2-TTTTTTTTTTTTTTT-Tagl 序列，Tagl8探针的序列结构为NH2-TTTTTTTTTTTTTTT-Tagl8序列。即探针的5'末端为氨 基修饰，氨基下游连接P〇ly-T15,然后是Tagl序列、Tag2序列、Tag3序列、Tag4序列、Tag5 序列、Tag6序列、Tag7序列、Tag8序列、Tag9序列、TaglO序列、Tagll序列、Tag 12序列、 Tagl3序列、Tagl4序列、Tagl5序列、Tagl6序列、Tagl7序列或Tagl8序列（Tagl序列至 TaglS序列依次为序列表中的序列1至序列18所示的单链DNA片段）。
[0124] QC是一端带有Hex标记，另一端具有氨基修饰的寡核苷酸探针，探针序列的5'端 连接有15个T，用于观察芯片点样和固定的效率，其核苷酸序列如序列表的序列19所示。 BC为基因点样液，点于QC之后，用于质控点样过程中有无样品残留污染。PC是一段氨基修 饰的寡核苷酸探针，探针序列的5'端连接有15个T，可以与杂交液中添加的荧光标记的互 补序列（c-PC)杂交，用于杂交过程的质控，其核苷酸序列如序列表的序列20所示。NC是 一段氨基修饰的寡核苷酸探针，探针序列的5'端连接有15个T，与杂交液中的所有待检测 序列不会杂交，用于观察有无非特异杂交，其核苷酸序列如序列表的序列21所示。IC是一 段氨基修饰的寡核苷酸探针，探针序列的5'端连接有15个T，与多重PCR扩增产物进行杂 交，用于多重PCR扩增过程的质控，其核苷酸序列如序列表的序列22所示。
[0125] 表1检测的突变位点、引物及Tag序列
[0126]
[0128] 所有的引物与探针由上海生工公司（Sangon, Shanghai, China)合成与纯化。
[0129] 将探针固定到醛基化修饰的玻片上。所有的Tag探针用基因点样液（Capitalbio， Bei jing，China)溶解，终浓度为15 μ M，每个点重复三次点制到玻片上。图2为通用芯片 的点阵排布示意图，其中包括检测VKORCl基因上的1639A>G、1173T>C SNP位点的Tagl至 Tag4探针，检测CYP2C9基因上的1075A>C SNP位点的Tag5、Tag6探针，检测CYP4F2基因 上的rs2108622C>T SNP位点的Tag7、Tag8探针，检测GGCX基因上的3261G>A SNP位点 的 Tag9、TaglO 探针，检测 CYP2C19 基因上的 681G>A、636G>A、806C>T SNP 位点的 Tagll 至 Tagl6探针，检测CYP3A4基因上的894C>T SNP位点的Tagl7、Tagl8探针。图2中，WlW即 1639W、代表Tagl探针，WlM即1639M、代表Tag2探针，W2W即1173W、代表Tag3探针，W2M即 1173M、代表Tag4探针，W3W即1075W、代表Tag5探针，W3M即1075M、代表Tag6探针，W4W即 『82108622￥、代表了3 87探针，财]\1即1821086221、代表了388探针，15￥即 3261￥、代表了&89 探针，W5M即3261M、代表TaglO探针，ClW即681W、代表Tagll探针，ClM即681M、代表Tagl2 探针，C2W即636W、代表Tagl3探针，C2M即636M、代表Tagl4探针，C3W即806W、代表Tagl5 探针，C3M即806M、代表Tagl6探针，C4W即894W、代表Tagl7探针，C4M即894M、代表Tagl8 探针。
[0130] 3、多重不对称基因特异性PCR扩增
[0131] 分别以各个SNP位点多态性样本的全血基因组DNA为模板，进行多重不对称PCR扩 增。为防止某些引物间的相互作用，多重PCR在两个离心管中进行。其中，引物1639A>G-WT， 1639A>G-MU 和 1639A>G-C，1173T>C-WT，1173T>C-MU 和 1173T>C-C，1075A>C-WT，1075A>C-MU 和 1075A>C-C， rs2108622C>T-WT， rs2108622C>T-MU 和 rs2108622C>T-C，3261G>A-WT， 3261G>A-MU和3261G>A-C在同一离心管中进行PCR扩增，表1中除上述五组引物以外的其 它四组引物在另一离心管中进行PCR扩增。
[0132] 多重不对称PCR反应体系的组成如下：反应总体积为25 μ 1，包括0. 2mM dNTPs, IXQiagen PCR buffer,添加 MgC12 至 2mM, ρΗ8· 7, 1 单位 HotStarTaq DNA Pol ymerase (Qiagen, Hilden, Germany)和IOOng基因组DNA，各位点的检测引物，其中共用 引物的浓度高于基因特异性引物。25 μ 1扩增体系中，采用不同引物时，各引物的浓度 如下：1639A>G-WT0. 05 μ M，1639A>G-MU0. 05 μ M，1639A>G-C0. 5 μ Μ，1173ΤΧΗΠ?. 03 μ Μ， 1173T>C-MU0. 02 μ Μ,1173T>C-C0. 45 μ Μ,1075A>C-ffT0.06 μ Μ,1075A>C-MU0.05 μ Μ, 1075A>C-C0. 6 μ Μ, rs2 108622OT-WT0. 04 μ Μ, rs2 108622OT-MU0. 03 μ Μ, rs2108622C>T-C0. 4 μ Μ，3261G>A-WT0. 03 μ Μ，3261G>A-MU0. 045 μ Μ，3261G>A-C0. 5 μ Μ， 681G>A-ffT0.06 μ Μ,681G>A-MU0.06 μ Μ,681G>A-C0. 8 μ Μ,636G>A-ffT0. 015 μ Μ, 636G>A-MU0.017 μ Μ，636G>A-C0.6 μ Μ，806C>T-WT0·06 μ Μ，806C>T-MU0·06 μ Μ， 806OT-C0. 6 μ Μ，894OT-WT0. 04 μ Μ，894OT-MU0. 045 μ Μ，894OT-C0. 45 μ Μ。
[0133] PCR 扩增的扩增参数为：95°C 15min ;96°C 3min ;96°C 25s、58°C 30s、72°C 40s， 36cycles ;72°C 6min ;4°C保存。
[0134] 4、通用芯片杂交
[0135] 将两个离心管中的PCR扩增产物分别96 °C变性5分钟再冰浴2分钟后混合，取 10 μ IPCR 混合物加到 20 μ 1 杂交缓冲液中（6 XSSC, SXDenhardt' S reagent, 25% 甲酰 胺，0. l%SDS，5nM c-PC;c-PC为与通用芯片上的PC互补的序列，5'末端标记有荧光染 料TAMRA)，然后从PCR产物与杂交缓冲液的混合物中再取出15 μ 1点样到通用芯片上后在 50°C水浴中杂交1小时。
[0136] 取出通用芯片，依次在洗液I和洗液II中洗涤（在每种洗液中42°C洗2min)，然后 将通用芯片稍离心甩干。洗液I :〇. 3XSSC/0. 1%SDS。洗液II :0. 06XSSC。
[0137] 为验证通用芯片的特异性，人工合成5'末端标记有荧光染料TAMRA的与Tagl序 列至Tagl8序列的反向互补的18种DNA分子（依次命名为cTagl序列至cTagl8序列），用 杂交缓冲液溶解至5nM，分别与通用芯片进行杂交，杂交与洗片条件同上。
[0138] 5、数据分析
[0139] 使用LuXScanTM10K激光共聚焦扫描仪及其配套软件 (Captialbio, Beijing，China)对通用芯片进行扫描，扫描图见图3。检测条件为：波长 555nm，Laser power 和 photomultiplier tube(PMT)power 分别为 90 和 600。
[0140] 图3显示的是用图2所示的通用芯片对心血管病人的临床样品进行实际检测的 结果。对于已知的野生型样品（WT)基因组DNA (gDNA WT)来说，依次进行PCR扩增和与通 用芯片杂交后，通用芯片上的野生型检测探针全部出现杂交信号，而下边的突变型检测探 针均没有杂交信号。对于已知的突变型样品（MU)基因组DNA(gDNA-MU)来说，依次进行 PCR扩增和与通用芯片杂交后，通用芯片上的野生型检测探针均没有杂交信号，而下边的突 变型检测探针全部出现杂交信号。对于已知的杂合型样品（HE)基因组DNA(gDNA-HE)来 说，依次进行PCR扩增和与通用芯片杂交后，通用芯片上的野生型检测探针全部出现杂交 信号，下边的突变型检测探针也全部出现杂交信号。gDNA1639A>G MU、gDNA1075A>C MU、 gDNA2108622C>T MU、gDNA3261G>A MU和gDNA681G>AMU分别为已知与华法林和氯吡格雷 个体化用药有关的 SNP 多态性位点 1639A>G MU、1173T>C MU、1075A>C MU、2108622C>T MU、 3261G>A MU和681G>A MU的病例样品的基因组DNA，代表了五种突变情况，杂交图中相 应的突变检测探针已经给出了相应的正确检测信号。gDNA1173T>C HE、gDNA636G>A HE、 gDNA806C>T HE和gDNA894C>THE分别为已知与华法林和氯吡格雷个体化用药有关的SNP多 态性位点1173T>C HE、636G>A HE、806C>T HE和894C>T HE的病例样品的基因组DNA，代表 了四种杂合情况，杂交图中相应的野生检测探针及突变检测探针已经给出了相应的正确检 测信号。由图3结果可知，所有位点检测结果都正确无误，特异性很好。
【主权项】
1. 一种用于检测华法林耐药性相关基因的多态性和氯吡格雷耐药性相关基因的多态 性的试剂盒，包括通用芯片、用于鉴别华法林耐药性相关基因的多态性的引物组合物甲和 用于鉴别氯吡格雷耐药性相关基因的多态性的引物组合物乙； 所述引物组合物甲包括一个以上引物组合物单元，每个引物组合物单元用于鉴别华法 林耐药性相关基因的一个多态性位点；所述引物组合物乙包括一个以上引物组合物单元， 每个引物组合物单元用于鉴别氯吡格雷耐药性相关基因的一个多态性位点； 每个所述引物组合物单元由两条特异性引物和一条共用引物组成，其中一条特异性引 物和所述共用引物的组合用于扩增野生型基因，另一条特异性引物和所述共用引物的组合 用于扩增突变型基因； 所述特异性引物由Tag序列和靶序列区段组成；所有所述特异性引物的5'末端具有 不同的Tag序列；所有所述Tag序列两两之间的Tm值之差均小于等于5°C ;所有所述Tag 序列之间、所有所述Tag序列与所有特异性引物的靶序列区段之间没有交叉杂交且无发夹 结构；所有所述Tag序列与含有所述基因的物种的基因组的同源性较低；所述同源性较低 是指连续匹配或相同的核苷酸数小于10个； 所述通用芯片上设有与所述Tag序列一一对应的Tag探针，每条Tag探针上具有与其 相对应的Tag序列。2. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述共用引物上具有荧光分子、可通过化 学发光进行标记检测的分子或可通过固体微粒进行标记检测的分子。3. 如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述多态性位点为SNP位点；每个引 物组合物单元中，一条特异性引物的3'末端核苷酸与一个SNP位点的野生型核苷酸相同 或互补，另一条特异性引物的3'末端核苷酸与该SNP位点的突变型核苷酸