用于检测华法林与氯吡格雷个体化用药相关基因的多态性的试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用于检测华法林与氯吡格雷个体化用药相关基因的多态性的试 剂盒及其应用。
【背景技术】
[0002] 华法林是一种香豆素类口服抗凝药，上世纪40年代由美国Wisconsin大学合成。 目前华法林被广泛用于预防和治疗静脉血栓、肺栓塞、慢性心房纤维颤动、心肌梗塞、缺血 性休克等多种血栓性疾病和人工心脏瓣膜植入手术，它的抗凝效果超过了目前批准的其它 口服类抗凝药。但由于华法林治疗指数窄，剂量个体差异大以及有出血危险，使得它位居严 重药物不良反应药物的前十名。随着药物遗传学的研究进展，国内外学者发现遗传因素是 影响华法林用量个体差异的主要原因 [Copper GM, Johnson JA, et al. 2008. A genome-wide scan for common genetic variants with a large influence on warfarin maintenance dose. Blood. 112(4) :1022-7.]。
[0003] 维生素 K环氧化物还原酶复合体（VKOR)是维生素 K循环中的关键酶，华法林是 该酶的特异性抑制剂，VKOR主要由VK0RC1 (维生素 K环氧化物还原酶复合体1)基因编码。 VKOR能够催化环氧化的维生素 K生成还原性维生素 K，还原性维生素1(是Y谷氨酰基羧化 酶（γ-glutamyl carboxylase, GGCX)的必要辅助因子。含有谷氨酸残基的维生素 K依赖 性凝血因子II、W、IX、X、蛋白质C和蛋白质S必需经过GGCX的羧化作用才具有活性，进而 发生一系列级联反应引起血液凝固。华法林能够抑制VKOR的催化反应，进而影响有活性的 凝血因子形成，最终阻止血液凝固。华法林经口服后大部分与血浆白蛋白结合，只有少量游 离华法林被肝脏吸收发挥生物学活性后被CYP2C9酶代谢。
[0004] 华法林是由S-对映体和R-对映体组成的消旋混合物，两种对应体被不同 的细胞色素 P450酶催化，其中，R-对映体是由CYP1A1、CYP1A2和CYP3A4酶代谢 [Yin T, MiyataT. 2007. Warfarin dose and the pharmacogenomics of CYP2C9and VKORCl-rationaleand perspectives. Thrombosis research. 120 (I) : 1-10. ]〇 S_ 华法林措 抗维生素 K的能力是R-华法林的5倍。在稳定状态下，S-华法林能够发挥60 % -70 %的 抗凝作用，并主要经 CYP2C9 酶代谢[Takahashi H, Echizen H. 2001. Pharmacogenetics of warfarin elimination and its clinical implications. Clinical Pharmacokinetics. 4 0(8) :587-603. ] 〇
[0005] 大量的研究和GWAS数据显示，VKORCl和CYP2C9基因多态性影响着个体对于 华法林剂量的需求[Klein TE，Altman RB, et al.2009.Estimation of the warfarin dosewith clinical and pharmacogenetic data.The New England journal of medicine. 361 (16) : 1613. ]。VKORCl 基因目前主要的研究位点有：1639A>G(rs9923231)和 1173T>C(rs9934438)。其中，VK0RC1-1639A>G位于基因启动子区，而11730T位于内含子 1区。VK0RC1基因启动子区1639A>G有三种基因型：AA型、AG型与GG型。Yuan等研究发 现，三种基因型中GG和AG基因型启动子活性较高，可能导致高水平的VKORClmRNA及蛋白 表达，VKORCl蛋白是华法林作用靶位点，因此GG和AG这两种基因型需要较大剂量华法林 来抑制VKORCl 蛋白[Yuan HY, Chen JJ, et al. 2005. A novel functional VKORClpromoter polymorphism is associated with inter-individual and inter-ethnic differences in warfarin sensitivity. Human molecular genetics. 14(13):1745-51.]〇 由于 1639A>G(rs9923231)和1173T>C基因多态性增加了对华法林的敏感性，因此降低了对华法 林的需求剂量。
[0006] CYP2C9基因具有遗传多态性，已知的CYP2C9的基因多态性超过30种（http:// www. cypalleles. ki. se/cyp2c9. htm)。其中CYP2C9*1为野生型，此外，最常见的两种突 变体为 CYP2C9*2 (rsl799853)、CYP2C9*3 (rsl057910)。CYP2C9*2 (rsl799853)突变体是 多肽链第144位氨基酸由Arg突变为Cys，导致该处的一个限制性内切酶Ava II位点丢 失，而CYP2C9*3(rsl057910)突变体是多肽链第359位氨基酸由Ile突变为Leu，导致 该处的一个限制性内切酶Ns i I位点的丢失。体外研究发现，CYP2C9*2和CYP2C9*3分 别影响S-华法林代谢的30-40 %和80-90%。目前研究显示，在中国人群中尚未发现 CYP2C9*2(rsl799853)纯合突变[Takahashi H，Echizen H. 2001. Pharmacogenetics of warfarin elimination and its clinical implications. Clinical Pharmacokinetics. 40(8) :587-603.]。此外，CYP4F2(rs2108622)多态性能够影响1% -2%的华法林个体差异 代谢[Caldwell MD, Awad T，Johnson JA. 2008. CYP4F2genetic variant alters required warfarin dose. Blood 111(8) :4106-12.]。另有研究表明 GGCX (rsl2714145)多态性与华法 林个体差异剂量相关[Chen LY，Eriksson N，Gwilliam R，Bentley D，Deloukas P, Wadelius M.2005.Gamma-glutamyl carboxylase (GGCX)microsatellite and warfarin dosing. Blood. 106(10) :3673-4.]。
[0007] 氯吡格雷，属于噻吩吡啶类抗血小板药物，目前被广泛应用于急性冠状动脉综合 征（ACS)和经皮冠状动脉介入治疗（PCI)的抗栓治疗。治疗目的有防治心肌梗死，缺血性脑 血栓，闭塞性脉管炎和动脉粥样硬化及血栓栓塞引起的并发症。氯吡格雷本身不具有生物 学活性，是一种药物前体，原型药物约85 %通过酯酶水解为无活性羧酸衍生物，大约15 % 通过肝细胞色素 P450酶代谢为2-氧-氯吡格雷，并进一步被氧化为活性代谢物-氯吡格 雷的硫醇衍生物，活性代谢产物不可逆地与血小板膜表面分布的P2Y1和P2Y12两种ADP受 体相结合，与P2Y12受体结合的作用更为显著，可使P2Y12受体失活，减少血小板膜ADP的 结合位点，阻断ADP对腺苷环化酶的抑制作用，促进cAMP依赖的舒血管物质磷酸蛋白的磷 酸化，抑制纤维蛋白原与血小板糖蛋白GP II b/ III a受体结合及继发的ADP介导的糖蛋白 GP II b/ III a复合物的活化，进而抑制血小板聚集。
[0008] 临床上将病人在常规氯吡格雷剂量治疗过程中仍然发生血栓的事件称为氯 批格雷抵抗。研究显示，氯批格雷抵抗发生率在4%-31%之间[Nguyen TA, Diodati JG, Pharand C. 2005. Resistance to clopidogrel:a review of the evidence. Journal of the American College of Cardiology. 45 (8) : 1157-64. ]。CYP2C19 是一种重要的 催化氯吡格雷生成活性代谢产物的酶，CYP2C19基因多态性被认为是氯吡格雷反应个 体差异性的重要决定因素，是氯吡格雷抵抗的可能机制之一。其中，研究最为广泛的为 CYP2C19*2型，即位于第五个外显子681G>A (rs4244285)，和CYP2C19*3型，位于第四个外显 子636G>A (rs4986893)，这两种突变使得酶的活性完全丧失从而发生氯吡格雷抵抗。除此 之外，CYP2C19*17(rsl2248560)型和CYP3A4(rs2242480)也是引起氯吡格雷反应个体差异 的重要因素 [Johnson JA, Cavallari LH, Beitelshees AL, Lewis JP, Shuldiner AR, Roden DM. 2011.Pharmacogenomics:application to the management of cardiovascular disease. Clinical pharmacology and therapeutics. 90(4):519-31. ]〇
[0009]目前，华法林与氯吡格雷两种药物在心血管疾病治疗方面被广泛的使用来用于抗 凝治疗。美国食品药品监督局（FDA)明确标注了在服用华法林与氯吡格雷两种药物前要注 意遗传信息，人的遗传差异可能影响对该药物的反应。临床上也提出在服用两种药物前要 进行基因型检测的强烈需求。此外，由于两种药的抗凝机制不同，在临床上也可能涉及到两 种药的联合使用或相互替代使用。而目前，国内尚无产品能够同时对两种药物相关的耐药 基因型进行检测。因此，有必要研发出一个可以同时检测华法林与氯吡格雷两种药物耐药 基因型的广品。
【发明内容】
[0010] 本发明的目的是提供一种用于检测华法林与氯吡格雷个体化用药相关基因的多 态性的试剂盒及其应用。
[0011] 本发明提供了一种用于检测华法林耐药性相关基因的多态性和氯吡格雷耐药性 相关基因的多态性的试剂盒，包括通用芯片、用于鉴别华法林耐药性相关基因的多态性的 引物组合物甲和用于鉴别氯吡格雷耐药性相关基因的多态性的引物组合物乙；
[0012] 所述引物组合物甲包括一个以上引物组合物单元，每个引物组合物单元用于鉴别 华法林耐药性相关基因的一个多态性位点；所述引物组合物乙包括一个以上引物组合物单 元，每个引物组合物单元用于鉴别氯吡格雷耐药性相关基因的一个多态性位点；
[0013] 每个所述引物组合物单元由两条特异性引物和一条共用引物组成，其中一条特异 性引物和所述共用引物的组合用于扩增野生型基因，另一条特异性引物和所述共用引物的 组合用于扩增突变型基因；
[0014] 所述特异性引物由Tag序列和靶序列区段组成；所有所述特异性引物的5'末端 具有不同的Tag序列；所有所述Tag序列两两之间的Tm值之差均小于等于5°C ;所有所述 Tag序列之间、所有所述Tag序列与所有特异性引物的靶序列区段之间没有交叉杂交且无 发夹结构；所有所述Tag序列与含有所述基因的物种的基因组的同源性较低；所述同源性 较低是指连续匹配或相同的核苷酸数小于10个；
[0015] 所述通用芯片上设有与所述Tag序列一一对应的Tag探针，每条Tag探针上具有 与其相对应的Tag序列。
[0016] 所述共用引物上具有荧光分子、可通过化学发光进行标记检测的分子或可通过固 体