用于阿尔海默氏症基因检测的生物试剂的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学领域的基因检测技术，尤其涉及用于阿尔海默氏症基因检 测的生物试剂、其制备方法以及用于检测的方法。
【背景技术】
[0002] 痴呆是一组以认知功能损害为核心症状的综合征。患者通常出现记忆、思维、定 向、理解、计算、语言等多种高级皮层功能的渐进性损害，这些损害可不同程度地干扰患者 的工作、日常生活及社交，最终使患者丧失自理能力。痴呆患者在65岁及以上人群中占 5. 4%，患病率随年龄增长而不断升高，其中以阿尔海默症（Alzheimer' s disease，AD)为 主。随着世界人口的老龄化加剧，AD患者与日俱增。在美国，估计有450万名AD患者，中 国AD患者人数也已超过500万，占全世界所有患病人数的1/4。随着人类寿命的延长，预计 未来30年痴呆患者数将成倍增长。阿尔海默氏症多为基因遗传因素、环境因素和衰老共同 致病，遗传因素影响占 AD全部风险的60 %至80 %。
[0003] 阿尔海默氏症的确诊主要通过临床诊断和一些辅助诊断措施进行，一般先检查病 史，并进行神经检查及简短的智能测验。基本检查有神经心理测试、血液常规、生化检查 (肝肾功能）、维生素 B12浓度、甲状腺功能、血清检查及脑部电脑断层或磁振造影等，特殊 情况亦有其他检查类型。如果有失去记忆导致忧虑的症状，就可能罹患了阿尔海默氏症，
[0004] 但必须经过医师的智能测验及脑部断层扫描才能确定。
[0005] 目前阿尔海默氏症的治疗方法主要是通过药物作用于不同的神经递质系统，增强 中枢神经系统的高级活动，减轻疾病过程中出现的各种症状，延缓痴呆的进一步发展。临床 上常用的治疗策略有：（1)增加脑内乙酰胆碱（Ach)浓度的药物；(2)促进脑内胆碱能神经 元的存活或提高其神经传导功能的药物；（3)减少β淀粉样蛋白的产生或促进其降解的药 物。
[0006] 阿尔海默氏症的检查手段耗时较长，诊断费用较高，并且不能对阿尔海默症进行 早期诊断。一旦确诊，阿尔海默氏症的后期护理费用是相当高的，而且治疗方面只能够延缓 病情，不能根治。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于应用分子生物学方面的常用手段一荧光定量PCR技术一快速、 有效地判断ApoE基因分型，用于阿尔海默症高危人群的筛查及早期诊断，实现阿尔海默症 的早发现，早预防，早治疗，减少患者患病后的痛苦并且减轻患者家庭的经济负担。
[0008] 为实现上述目的，本发明提供了一种用于阿尔海默氏症基因检测的生物试剂、其 制备方法以及用于检测的方法。
[0009] 本发明提供了一种用于阿尔海默氏症基因检测的生物试剂盒。所述试剂盒的组分 包括：引物、探针、DNA聚合酶、聚合酶缓冲、dNTP、DMSO以及无菌去离子水。
[0010] 阿尔海默氏症基因检测的试剂盒的制备方法主要包括下述步骤： toon] 1)确定待测基因片段：根据科技文献的方向性报道初步选定候选基因片断，然后 经研发过程中与待检样本病理相关性的比较，最终确认与临床疾病最具相关性的待测基因 片断；
[0012] 2)根据所述待测基因片段设计引物和探针，并采用多核苷酸合成仪生产所述引 物；
[0013] 3)提取血液基因组DNA :用人血液基因组提取试剂盒提取病人组及对照组的基因 组 DNA ;
[0014] 4)确定荧光定量PCR扩增条件，其包括酶、引物、探针：不同组合的引物片断，根据 实验结果的特异性，敏感性等技术特征，反复试验，同时进行多条所述待测基因片断的检测 反应，最终确定包括所述引物、探针、所述酶的反应条件，其中，荧光定量PCR扩增的结果软 件来自动分析；
[0015] 5)进行重复性检测以进一步确定反应条件：通过大量实验，反复比较实验结果中 包括清晰度和灵敏性的因素，最终确定反应条件；
[0016] 6)根据最终确定的所述反应条件，制备试剂盒，其组分包括：引物、探针、DNA聚合 酶、聚合酶缓冲、dNTP、DMSO以及无菌去离子水。
[0017] 又一方面，本发明还提供了采用本发明试剂盒进行阿尔海默氏症基因检测的方 法。
[0018] 采用本发明的试剂盒进行阿尔海默氏症基因检测，其中所述试剂盒的组分包括： 引物、探针、DNA聚合酶、聚合酶缓冲、dNTP、DMSO和无菌去离子水。
[0019] 本发明以用基因组提取试剂盒提取的病人的血液基因组DNA为模板，用试剂盒提 供的DNA聚合酶、引物、探针等组分，20 μ L反应体系，按照特定的比例分别加入，设置程序， 用荧光定量PCR仪进行扩增并获得检测结果，从而实现对阿尔海默氏症的基因检测。
[0020] 本发明的技术关键涉及探针及引物的设计，引物的生产，荧光定量PCR反应体系 和反应条件的确定等。
[0021] 所用DNA合成仪为德国polygen，引物的制备方法是采用固相亚磷酰胺三酯法，亚 磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。亚磷 酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的，合成是由待合成引物的3'端 向5'端合成的，相邻的核苷酸通过3' 一5'磷酸二酯键连接。
[0022] 本发明采用荧光定量PCR的方法通过基因扩增检测ApoE基因分型，方法设计 和流程比较简单；使用方便，无需特殊仪器和酶切、跑电泳等步骤；耗时较短，只需一个半 小时即可完成检测；检测效率高，一次可同时检测数十个临床样本，结果可靠，有效，一次 反应检测六类 ApoE 的分型（homozygous genotypes:E2/E2，E3/E3, E4/E4, heterozygous genotypes:E2/E3, E2/E4, E3/E4)，可用于阿尔海默症的筛查和临床诊断，具有相当大的市 场潜力。
【附图说明】
[0023] 图1为根据本发明的一种【具体实施方式】进行基因检测的图示。
[0024] 图2为正常对照组和阿尔海默氏症PCR基因扩增结果对照图.
【具体实施方式】
[0025] 在对本发明作进一步描述之前，应当理解本发明并不局限于下述有关发明的具体 实施方式。同时也应当理解，本文所使用的术语只是用于针对特定的实施方式进行描述，而 不是用来进行限制。
[0026] 实施例1.弓丨物组合的确定
[0027] 设计合成引物见下表。
[0028]
[0029] 实施例2.探针组合的确定
[0030] 设计合成MGB探针组合见下表。
[0031]
[0032] 实施例3.引物的制备
[0033] 采用德国polygen多核苷酸合成仪合成所需引物，其步骤包括：
[0034] 1)开启