一种多重pcr在败血症真菌检测中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明设计分子生物学技术领域，具体涉及一种多重PCR体系对真菌性败血症进 行快速诊断的方法。多重PCR技术，适用于感染性疾病、肿瘤、遗传病的检测。
【背景技术】
[0002] 目前对真菌性败血症快速准确诊断，尚缺乏可靠的检测方法，早期快速诊断，对于 真菌性败血症的治疗、预后及耐药性预防，都具有重要意义。在普通外科的病人中血液真菌 感染病人病死率高达27%~64%。外科危重病人一旦罹患真菌感染，病死率明显上升。念 珠菌败血症在医院感染败血症中居第4位，病死率更是高居首位。真菌性败血症的高死亡 率是因为其起病急，后果严重，临床诊断比较困难。该病症常无特异症状和体征，与细菌感 染不易区分，易漏诊或误诊为细菌感染而尝试性地使用广谱抗生素，反而易于导致菌群失 调加重病情。
[0003] 真核生物基因组中编码核糖体的基因包括28S rDNA、5S rDNA、18S rDNA和5. 8S rDNA 4种，它们在染色体上头尾相连、串联排列，相互之间由间隔区分隔。其中18S、5. 8S和 28S rDNA基因组成一个转录单元，三者高度保守。其间的间隔区为内转录间隔区（Internal Transcribed Spacer，ITS)，包括ITSI及ITS2两部分，其进化相对迅速而具多态性。本技 术基于rDNA - ITS基因多态性的序列分析，选取真菌的rRNA及转录间区片段作为PCR目的 基因，以保守序列设计待测真菌的上游通用引物（5' -GCATCGATGAAGAACG-3'），以高变区设 计下游特异性引物，既减少了所需引物的数量，又保证了检测的高度特异性。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种多重PCR体系对真菌性败血症进行快速诊断的方法。
[0005] 本发明设计了一种多重PCR体系，该体系能够弥补已有真菌检测方法的不足，为 发病急、死亡率高的真菌性败血症及脓毒症临床治疗提供明确的用药信息，从而赢得宝贵 的治疗时间。
[0006] 本发明提供了一种多重PCR技术，其特征在于能够快速、准确、高效的检测真菌， 技术简便，易于操作和推广，有着非常广阔的应用空间。
[0007] 本发明所采用的技术方案的主要内容是： 一种真菌多重PCR检测方法，主要包括以下序列： 体系一： 白假丝酵母：上游引物：5' - GCATCGATGAAGAACG -3' 下游引物：3' - CGGGTAGTCCTACCTGATTT -5' 近平滑假丝酵母：上游引物：5' - GCATCGATGAAGAACG -3' 下游引物：3' - CGGGTAGTCCTACCTGATTT -5' 季也蒙假丝酵母：上游引物：5' - GCATCGATGAAGAACG -3' 下游引物：3' - CGGGTAGTCCTACCTGATTT -5' 热带假丝酵母：上游引物：5' - GCATCGATGAAGAACG -3' 下游引物：3' - CGGGTAGTCCTACCTGATTT -5' 维斯假丝酵母：上游引物：5' - GCATCGATGAAGAACG -3' 下游引物：3' - CGGGTAGTCCTACCTGATTT -5' 葡萄牙假丝酵母：上游引物：5' - GCATCGATGAAGAACG -3' 下游引物：3' - CGGGTAGTCCTACCTGATTT -5' 克柔假丝酵母：上游引物：5' - GCATCGATGAAGAACG -3' 下游引物：3' - CGGGTAGTCCTACCTGATTT -5' 光滑假丝酵母：上游引物：5' - GCATCGATGAAGAACG -3' 下游引物：3' - CGGGTAGTCCTACCTGATTT -5' 新生隐球菌：上游引物：5' - GCATCGATGAAGAACG -3' 下游引物：3' - CGGGTAGTCCTACCTGATTT -5' 米根霉：上游引物：5' - GCATCGATGAAGAACG -3' 下游引物：3' - CTATAGAAAAACCATAGAGG -5' 少根根霉：上游引物：5' - GCATCGATGAAGAACG -3' 下游引物：3' - CTATAGAAAAACCATAGAGG -5' 体系二： 克柔假丝酵母：上游引物：5' - GCATCGATGAAGAACG -3' 下游引物：3' - TTGTTGTCTCGCAACACTCG -5' 烟曲霉：上游引物：5' - GCATCGATGAAGAACG -3' 下游引物：3' - CGTTCTTCATCGATGC -5' 土曲霉：上游引物：5' - GCATCGATGAAGAACG -3' 下游引物：3' - CGTTCTTCATCGATGC -5' 黄曲霉：上游引物：5' - GCATCGATGAAGAACG -3' 下游引物：3' - CGTTCTTCATCGATGC -5' 黑曲霉：上游引物：5' - GCATCGATGAAGAACG -3' 下游引物：3' - CGTTCTTCATCGATGC -5' 茄病镰刀菌：上游引物：5' - GCATCGATGAAGAACG -3' 下游引物：3' - CGCTCGAACAGGCATGCCCG -5' 串珠镰刀菌：上游引物：5' - GCATCGATGAAGAACG -3' 下游引物：3' - CGCTCGAACAGGCATGCCCG -5' 尖胞镰刀菌：上游引物：5' - GCATCGATGAAGAACG -3' 下游引物：3' - CGCTCGAACAGGCATGCCCG -5' 尖端赛多孢：上游引物：5' - GCATCGATGAAGAACG -3' 下游引物：3' - CGCTCGAACAGGCATGCCCG -5' 尖端赛多孢：上游引物：5' - GCATCGATGAAGAACG -3' 下游引物：3' - CGCTGCCTTTCGGGCAG -5' 土曲霉：上游引物：5' - GCATCGATGAAGAACG -3' 下游引物：3, _ GGTCAACCTGGAAAAATAAA _5' 本发明以保守序列设计待测真菌的上游通用引物，以高变区设计下游特异性引物，从 病原真菌的种属角度利用多重PCR技术对真菌进行分组鉴定。同时本发明选用引物是在各 引物浓度为6pmol的等摩尔条件下进行扩增，扩增产物通过普通的琼脂糖凝胶电泳即可有 效的分开，方法简单易行。灵敏度达到l〇fg，优越性非常明显。
[0008] 本发明还涉及一种真菌多重PCR检测方法，包括： (1) 选取引物序列包括(如上所述） (2) 提取真菌和细菌DNA，作为模板，在包括步骤（1)所述引物序列的PCR反应体系中 进行PCR反应。
[0009] 所述PCR反应体系1总体积为30 μ L，其组成为： 20xPCR Buffer 1. 5μ L 50mM MgCl2 LOyL 共用上游引物及体系I两条特异性引物 各6pmol TaqDNA聚合酶 IU DNA模板 2 μ L 以双蒸去离子水补足体积 PCR反应条件为： 预变性941：51^11;变性941：6〇8，退火681：6〇8，延伸721：458,35个循环；终延伸 72 〇C 5min〇
[0010] 所述PCR反应体系2总体积为30 μ L，其组成为： 20xPCR Buffer 1. 5μ L 50mM MgCl2 LOyL 共用上游引物及体系2两条特异性引物 各6pmol TaqDNA聚合酶 IU DNA模板 2 μ L 以双蒸去离子水补足体积 PCR反应条件为： 预变性941：51^11;变性941：6〇8，退火681：6〇8，延伸721：458,35个循环；终延伸 72 〇C 5min (3 )取PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果是否出现特异性条带，判断是 否含有对应真菌。
[0011] 本发明所检测的真菌基因是目前临床常见的致病真菌，因此本发明具有实用性； 其次，本发明的方法可以缩短检测时间，单个样品从样品制备到结果检出只要6个小时；本 发明检测所用方法为常规定性PCR和普通琼脂糖凝胶电泳检测，只需要目前常规的分子生 物学试剂，成本低；另外本发明检测灵敏度高，能达到IOfg水平，同时相比于单引物PCR检 测，本发明准确率高，假阳性比率低。通过不同的PCR仪对比检测以及不同的检测人员操作 比对均能得到稳定的检测结果。
[0012] 本发明的有益效果主要体现在：可快速、准确检测多重真菌，灵敏度高，且成本低， 准确率高，假阳性率低。
【附图说明】
[0013] 图1是RNA基因及转录间隔区不意图； 图2是选取的真菌目的基因相似性对比； 图3是反应体系1的PCR特异性电泳图 (M. DL2000，1.白假丝酵母，2.近平滑假丝酵母，3.光滑假丝酵母，4热带假丝酵母， 5.季也蒙假丝酵母，6.克柔假丝酵母，7.葡萄牙假丝酵母，8.维斯假丝酵母，9.新生隐球 菌，10.米根霉，11.少根根霉，12.烟曲霉，13. 土曲霉，14.黄曲霉，15.黑曲霉，16.尖端赛 多孢，17.串珠镰刀菌，18.茄病镰刀菌，19尖胞镰刀菌，20.双蒸去离子水）； 图4是反应体系2的PCR特异性电泳图 (M. DL2000，1.白假丝酵母，2.近平滑假丝酵母，3.光滑假丝酵母，4热带假丝酵母， 5.季也蒙假丝酵母，6.克柔假丝酵母，7.葡萄牙假丝酵母，8.维斯假丝酵母，9.新生隐球 菌，10.米根霉，11.少根根霉，12.烟曲霉，13. 土曲霉，14.黄曲霉，15.黑曲霉，16.尖端赛 多孢，17.串珠镰刀菌，18.茄病镰刀菌，19尖胞镰刀菌.，20.双蒸去离子水）； 图5是PCR灵敏度电泳图 (M 为 DL2000, 1 为 Ing 的 DNA，2 为 IOOpg 的 DNA，3 为 IOpg 的 DNA，4 为 Ipg 的