硫柳汞在荧光定量pcr中的应用

硫柳汞在荧光定量pcr中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明针对生物化学领域，涉及硫柳汞在荧光定量PCR中的应用，特别是用于核 酸检测荧光定量PCR。
【背景技术】
[0002] 定量PCR是在定性PCR基础上发展起来的核酸定量技术。实时荧光定量PCR技术 (Real-time Fluorescent Quantitative Polymerase Chain Reaction, FQ-PCR)于 1996 年由美国Applied Biosystems推出，它是在PCR反应体系中加入荧光探针，通过荧光信 号的不断积累来实时监测整个PCR过程，最后通过标准曲线来计算出待测样品的起始拷 贝数。该技术不仅实现了 PCR从定性到定量的飞跃，并且与普通PCR相比，它具有范围宽 (0-1 X 10s)、灵敏度高(可检测〈5个拷贝）、特异性强、精确度高（CV〈2%)、无需后续处理、避 免了交叉污染及可以进行多重检测的优点而被广泛应用于科研及临床诊断等领域。
[0003] PCR增强剂在PCR反应中起到提高反应的特异性、增加 PCR扩增灵敏度及防止无效 扩增等有益效果而被广泛应用于PCR体系中。迄今为止，在提高PCR扩增能力、增强反应体 系稳定性的研究中，人们已经发现了越来越多的PCR增强剂和稳定剂，它们都以各自的特 性在不同的方面对PCR反应起着促进作用。如甲酰胺是被较早发现并广泛应用的PCR添加 剂之一，据报道，它能显著提高PCR反应的特异性。Rapley等人于1994年研究发现T4噬菌 体基因32编码蛋白及大肠杆菌单链结合蛋白对数种模板的PCR反应均有提高效率的作用。 Rees WA等人通过研究发现在长片段PCR中添加甜菜碱能降低热变性温度和退火温度，进 而能促进高GC含量片段的扩增，而且还能提高PCR产物的产量。Eric Chevet等人发现在 体系中添加氯化四甲基铵（TMC)可以提高AT含量丰富的DNA片段的Tm值，从而通过改善 引物的特异性结合来提高PCR反应的特异性。牛血清白蛋白（BSA)则能够通过防止聚合酶 的变性提高扩增反应效率。DMSO是用于增强反应特异性的常见添加剂，加入DMSO有利于减 少DNA的二级结构，使高GC含量的模板的易于完全变性。
[0004] 随着对PCR增强剂的研究深入，人们逐渐从研究和应用单一型PCR增强剂转向研 究和应用复合型PCR增强剂。Musso等应用I. 3M甜菜碱，50uM7-deaza-dGTP及5% DMSO混 合而成的复合型增强剂高产量扩增了 GC含量为79%的长度为392bp的DNA片段，接下来在 另外两段DNA片段（GC含量为67. 8%和72. 7% )的扩增中这种复合型PCR添加剂同样能帮 助获得高特异性的扩增产物。随着荧光定量PCR应用的进一步扩大，传统PCR增强剂已经 不能满足日新月异的PCR体系，近年来，科研人员已经将目光转向新材料、新化合物。比如 纳米材料等。但是，多年来人们对这些添加剂的研究表明，它们在一定的浓度范围内对某些 PCR有着增效作用，但在另外一些情况下或在其它的浓度范围内对PCR反应又有着抑制作 用，所以PCR添加剂在不同反应体系中的应用应通过试验来合理选择，因此，优化的PCR反 应体系配方或添加剂组合会使PCR反应获得很大的改善。
[0005] 硫柳汞（LLG，又称乙汞硫柳酸钠）是一种有机汞化合物，长期以来，作为安全的防 腐剂一直被广泛用于生物制品及药物注射剂中（包括乙肝疫苗、百日咳疫苗、眼药水、免疫 球蛋白等)，有报道表明0. 0001%~0. 02%即可对生物制品起到有效抑菌作用。硫柳汞在体 内能被代谢变成二乙基汞和硫基水杨酸盐，乙基汞能够通过肠道被积极排除出去，而不像 甲基汞那样在体内积累发生毒性反应。叠氮钠是一种常用于生物试剂或溶液保存的防腐 剂，但它对热不稳定，水溶液遇酸放出剧毒的HN 3，和氰化物相似，对细胞色素氧化酶和其它 酶有抑制作用。因此，与叠氮钠相比，硫柳汞作为防腐剂毒性更低、更为安全，对环境污染更 小。
[0006]
[0007] 目前，申请人在研发荧光定量PCR体系配方试验中添加有一系列低浓度的硫柳汞 作为防腐剂，通过实验结果意外发现，添加硫柳汞不但能起到防腐剂的作用，它还能与海藻 糖、聚乙二醇、甘油等已知的PCR增强剂起到"协同增强作用"，提高PCR反应的扩增效率及 灵敏度。这一发现为开发新型荧光定量PCR反应体系配方，提高包括临床检测试剂在内的 各种核酸类荧光定量PCR检测试剂的特异性、灵敏度及稳定性提供了极大的帮助。
[0008] 经分析，硫柳汞对PCR反应的增强作用可能与其含硫环状结构有关。对比对PCR 反应具有明显增强作用的亚砜类物质，如tetramethylene sulfoxide,有研究者认为亚砜 类环状结构化合物的独特作用效果可能是由于其破坏了模板DNA大沟和小沟里带有供体 和受体互补氢键的理想构象，也有可能其通过限制DNA链的自由旋转而使得DNA骨架的相 邻基团间位间排斥减小。另外，对比对PCR有增强作用的物质L-ectoine和homoectoine， 在六元环上均有一羧基存在,硫柳汞与它们有类似结构。
[0009] 对比观察硫柳萊、L_ectoine、Homoectoine 和 tetramethylene sulfoxide 的结构 式如下：



【发明内容】

[0012] 本发明的目的在于提供硫柳汞作为一种新型增强剂在荧光定量PCR中的应用。硫 柳汞在荧光定量PCR反应液中具有增加反应灵敏度、特异性和提升荧光值的效果，单独添 加时起到"增强剂"的作用，配合其他试剂添加时起到"协同增强剂"的作用。
[0013] 硫柳汞作为协同增强剂时，所述反应液还包含有甘油、聚乙二醇、海藻糖、硫酸铵 和氯化铵中的一种或多种。
[0014] 甘油、聚乙二醇、海藻糖、硫酸铵和氯化铵等在荧光定量PCR中，作为反应增强剂 能促进耐热DNA聚合酶对高GC含量的DNA模板的有效扩增，增加 PCR反应的特异性及灵敏 度。其原理主要有通过降低DNA二级结构、提高DNA聚合酶的热稳定性等机制而达到提高 目标片段扩增率。其中，海藻糖有助于提高GC含量及片段DNA的扩增。质量分数为2%-10% 的甘油能增加酶的稳定性，提高扩增效率。氯化铵或硫酸铵能增加反应配方的离子强度，通 过改变退火温度来间接调节酶活。聚乙二醇能改变引物与模板配对反应的溶解温度，进而 改善高GC含量DNA的变形情况，使耐热DNA聚合酶更容易在二级结构处延伸。
[0015] 经申请人实验推测，硫柳汞是通过与【背景技术】部分结构类似的增强剂相似的机理 发挥作用，实践中可根据需要，选择一种或多种增强剂与其相配合。
[0016] 进一步，所述反应液还包含有耐热DNA聚合酶，所述DNA聚合酶具有5'-3'聚合酶 活性和5' -3'外切酶活性，如Taq DNA聚合酶；所述DNA聚合酶还可以是具有5' -3'聚合 酶活性和3' -5'校正活性的DNA聚合酶，如pfu。
[0017] 上述耐热DNA聚合酶优选热启动DNA聚合酶，包括化学修饰、抗体修饰或配基修饰 (DNA酶抑制剂，以及单链或双链寡核苷酸抑制物修饰)的DNA聚合酶。热启动DNA聚合酶在 常温至50°C范围聚合酶活性被封闭，因此，可以有效抑制由于引物与模板非特异性结合，或 引物聚体引起的非特异性扩增，从而增加反应的特异性和灵敏度，以及反应体系的稳定性。
[0018] 本发明还提供一种包含有硫柳汞的定量PCR反应液，所述反应液包含的组分终浓 度(未注明浓度单位的均为质量浓度）：IO-IOOmM Tris-HCl，PH7. 7-9. 0、0. 0001-0. 01%的硫 柳汞，1-10% 的 PEG4000 或 100-600mM 海藻糖，0-50mM 或 O-IOOmM KCl，0-50mM(NH4)2S04 或 順4(：1，0.2-0.41111(1犯13,2-1211111%2+，2-10%甘油和0.01-0.21]/^1热启动0嫩聚合酶。
[0019] 上述反应液所包含的组分终浓度，作为优选的，硫柳汞为0. 004-0. 006%，海藻糖为 180-220mM，PEG4000 为 2-8%，（NH4)2SO4 或 NH4Cl 为 10-30mM，MgCl2 为 2-8mM，甘油为 5-10%， 热启动DNA聚合酶为0.08-0. 12U/μ 1。
[0020] 本发明还涉及一种荧光定量PCR试剂盒，所述试剂盒包含上述含有硫柳汞的任何 一种反应液。
[0021] 本发明的有益效果：本发明涉及硫柳汞的一种新用途，对于PCR反应而言，其除了 能作为防腐剂提高反应液的稳定性之外，还能单独或与其他PCR增强剂一起协同提高PCR 反应的扩增效率、灵敏度，以及增加荧光值。另外，本发明的反应液配方避免了常规PCR体 系配方中因添加其他剧毒防腐剂，如叠氮钠等带来的环境污染的弊端，为开发硫柳汞在新 的领域中的应用奠定了基础。
【附图说明】
[0022] 图1荧光定量PCR探针法扩增曲线图；
[0023] I (配方1):优化前体系的扩增曲线
[0024] II (配方2):单独加入硫柳汞的扩增曲线
[0025] III (配方3):单独加入海藻糖的扩增曲线
[0026] IV (配方4):同时加入硫柳汞和海藻糖的扩增曲线
[0027] 图2四种反应体系Ct值比较；
[0028] 图3四种反应体系荧光值比较；
[0029] 图4荧光定量PCR SYBR Green染料法扩增曲线图；
[0030] I (配方5):优化前体系的扩增曲线
[0031] II (配方6):单独加入PEG4000的扩增曲线
[0032] IIK配方7):单独加入硫柳汞的扩增曲线
[0033] IV (配方8):同时加入硫柳汞和PEG4000的扩增曲线
[0034] 图5四种反应体系Ct值比较；
[0035] 图6四种反应体系荧光值比较。
【具体实施方式】
[0036] 以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具 体条件的实验方法，通常按照常规条件。实施例中所用的试剂或仪器未注明生产厂商的，均 为可以通过市面购到的常规产品。下文未注明浓度单位的均为质量浓度。
[0037] 实施例1荧光定量PCR Taqman探针法比较