胶或其它物理载 体）的表面上。所述变化和更多变化的实例在附录A-D中论述。
[0139] 所公开方法的修改将通常设及在净化期间加入盐或其它添加剂W防止期望产物 通过与可溶性或不可溶的正电性或负电性有机离子的强烈相互作用而发生损失。
[0140] 因为使用本文中所公开的方法获得的结果随化学工艺而变，所W应理解，虽然所 有的物理形式都能够实现类似结果，但可能W不同程度的效率、不同的流体体积和不同的 时间间隔来实现。普通技术人员有能力确定如何有效地针对特定应用配置所述方法。
[0141]连施例
[0142] 实施例1.用于执行沉淀的化C1浓度的选择。通过离屯、和膜过滤净化含有1. 2g/L 单克隆抗肥R2 IgG的1L细胞培养上清液。运种抗体的等电点为约8.6。加入1%尿囊素， 随后加入0.025%最终浓度的依沙叮晚。通过过滤移除固体。组合相等比例的带正电的金 属亲合性粒子度ioWorks TREN hi-sub)、带负电的金属亲合性粒子烟ielex-100)和带正 电的疏水性粒子值owex AG 1x2400目）。将20mL粒子混合物装填入被平衡到大致生理条 件的1. 6x 10cm柱中，并且样品W 300cm/虹的线性流速流过所述柱。经过处理的肥R2包 含165, 66化pm宿主细胞蛋白质污染。其在抑7下在18%阳G-6000溶液中沉淀。通过经 由平均0.22微米孔径的不带电膜过滤来移除上清液。沉淀物再悬浮在50mM化pes、18% PEG (pH 7.0)中，并且通过在相同的膜上过滤来移除上清液。抗体然后在50mM H巧es (pH 7.0)中溶解。在平行实验中，将化Cl加入到原始样品中W产生等于200mM的盐浓度。还 将200mM化C1加入到再悬浮缓冲液中。在另外的平行实验中，将化C1浓度升高到400、800 和lOOOmMNaCl。测量来自每个实验的再溶解抗体中的污染性宿主细胞蛋白质的浓度。水 平如下：未加入化(：1，16,544口口111;2001111 化(：1，1，984卵111;4001111 化(：1，6051111 化(：1;8001111 NaCl，50wm;1000mMNaCl，3^pm。
[014引实施例2.除了不向原始样品中加入盐之外，在800mM化C1下重复实施例1的实 验。再溶解的抗体含有155ppm宿主细胞蛋白质。在其中长时间或重复接触再悬浮缓冲液 的后续实验中，污染性宿主蛋白质的浓度降低到约70ppm。运突出了W下要点，即当初始沉 淀步骤在较高的盐浓度下执行时，性能得到提高。
[0144] 实施例3.实施例2的基本形式，其中不向原始样品中加入盐，但是包括在洗涂再 悬浮沉淀物的过程中长时间接触800mM化C1。随后用50mMTris、18%阳G(抑8.0)洗涂沉 淀出的IgG，然后将抗体溶解在50mM化is(pH8.0)中。宿主蛋白质污染被降低到88ppm; 仍然劣于当在高盐浓度下执行初始沉淀时获得的结果。
[0145] 实施例4.除了W包含细胞的细胞培养采集物开始之外，重复实施例3的实验。结 果基本上没有改变，证明了所述调节方法的优势适用于含细胞的蛋白质制剂和不含细胞的 蛋白质制剂两者。
[0146] 实施例5.重复实施例3的基本形式，例外是用1M化Cl、50mM化pes(抑7. 0)再溶 解IgG，然后将IgG施加于lOmL的被平衡到相同条件的疏水性阴离子交换剂Captoa化ere 的柱，然后用下降梯度的50mM胎pes(pH7.0)洗脱。在样品施加后，残余的PEG流过该柱 并且因此被清除。在梯度下洗脱IgG。洗脱出的IgG中的宿主蛋白质污染小于Ippm。运个 实施例突出了本文中所公开的方法能够在仅仅两个分级分离步骤中实现对被调节IgG的 异常高程度的抗体纯化。将理解本文中所公开的方法实现所述低水平的宿主蛋白质污染的 能力使得许多所述2步程序可行。
[0147] 实施例6.除了在IgG即将再溶解之前W2%的体积比引入DowexAGlx2形式的疏 水性的正电性多孔粒子之外，重复实施例3的基本形式。宿主蛋白质污染被降低到21ppm。 抗体回收率为90%。在平行实验中，用UNOsphereQ替代Dowex粒子。宿主蛋白质的减少 是相同的，但抗体回收率为95 %。
[0148] 实施例7.除了将被净化的细胞上清液的盐浓度升高至1M化C1之外，重复实施例 6的基本形式。W4%v/v的比例加入UNOsphereQ形式的阴离子交换粒子。使50mMTris、 IM化Cl中的阳G-6000至19 %PEG的最终浓度W沉淀抗体。通过经由0. 22微米非离子性膜 过滤来移除上清液。将沉淀物和粒子再悬浮于19%阳G-6000、lM化Cl、50mM化is(pH8.0) 中，并且再次通过过滤移除上清液。沉淀物和粒子然后再悬浮于19%PEG、50mMTris(pH 8.0)中，在揽拌下解育15分钟，然后通过经由相同的过滤器过滤来移除上清液。重复运个 洗涂，然后用50mMTris(pH8.0)溶解抗体。将再溶解的抗体和正电性粒子轻轻地混合30 分钟W提供酸性宿主蛋白质结合到粒子上的机会，然后经由膜过滤抗体溶液，留下粒子。抗 体的宿主蛋白质浓度为18ppm。抗体回收率为93%。
[0149] 实施例8.执行一系列实验，其中在2维矩阵中评估IgG纯化和回收率，所述2维 矩阵评估16%、18%、20%和22%的阳6-6000浓度对比0.0、0.5、1.0、1.5和2.01的化(：1 浓度。原材料是通过微滤专口地净化的含IgG的上清液。IgG回收率、纯度和可复现性W及 阳G浓度之间的变异在约1M化C1是最佳的。1. 5M化C1下的纯度是大致相同的，但是回收 率下降。0. 5M化C1下的回收率略微更好，但是纯度低于1.0M化C1下的纯度。在不存在 化C1的情况下和2.0M化C1下，纯度和回收率都严重下降。
[0150] 实施例9.纯化IgM的集成方法.通过离屯、和膜过滤净化含有120mg/L单克隆 IgM克隆529的1L细胞培养上清液。运种抗体的等电点为约6. 0。加入固体氯化钢W实现 25mS/cm的最终电导率。加入1 %尿囊素，随后加入0.025%最终浓度的依沙叮晚。通过过 滤移除固体。组合相等比例的强阴离子交换粒子（Macroprep化曲-Q)、带负电的金属亲合 性粒子（化elex-100)和强阳离子交换带电粒子（Macroprep化曲-S)。将20血粒子混合 物装填入被平衡到大致生理条件的1.6x10cm柱中，并且样品W200cm/虹的线性流速流过 所述柱。经过处理的肥R2包含165,66化pm宿主细胞蛋白质污染。在对照实验中，通过用 13%PEG-6000沉淀和在25mS/cm的电导率下洗涂来纯化抗体。剩余的宿主蛋白质污染为 1383ppm。在平行实验中，通过相同方法但在47mS/cm的电导率下纯化抗体。剩余的宿主蛋 白质污染为69ppm。随后用阴离子交换和阳离子交换色谱纯化，运将宿主蛋白质浓度降低到 小于3ppm〇
[0151] 实施例10.通过加入1 %尿囊素然后加入0.025 %依沙叮晚来调节包含 275,357ppm宿主细胞蛋白质、528化pmDNA和13.96%聚集体的含IgG的细胞培养采 集物，然后混合 15 分钟。MacroPrepHi曲Q、Mac;roPrepHi曲S、Mac;roprep1:But5d 和Qielex-lOO度io-RadL油oratories)的均等混合物预先通过用50mM肥阳S、100mM 化Cl(pH7.0)洗涂来平衡。将经平衡的混合粒子W2% (V:V)的量加入不纯的IgG制剂， 然后在4-8°C过夜混合。通过微滤移除固体。将1.25mg包被有淀粉的200nm磁性粒子加入 到20血被调节的不纯的IgG制剂中。在满旋混合器上在50化pm下混合的同时，逐渐加入 20ml的36%阳G-6000于1.6M化Cl、50mM肥阳S(抑7. 0)中的溶液，W产生18%阳G-6000 和0.8M化C1的最终浓度。满旋混合继续30分钟，然后用磁性方式收集负载有IgG的粒 子。用新鲜的50mM肥阳S、0.8M化Cl(pH7. 0)洗涂负载有IgG的粒子，并且移除洗涂溶 液。移除洗涂缓冲液并且W相同方式再次洗涂粒子。移除洗涂缓冲液，并且将抗体再溶解 于50mM肥阳S、1M化Cl(pH7)中。1血柱装填有正电性疏水性色谱介质（Gaptoa化ere, GEHealthcare)并且被平衡到相同条件。将溶解的IgG施加于柱上，其中结合的IgG和一 些污染物被认为已经结合，同时残余PEG也结合。然后施加含有平衡缓冲液的5倍柱体积 的洗涂溶液W更彻底地从系统上移除未结合的组分。用W50ml肥阳S、300ml化C1(pH 7.0)结束的10倍柱体积的线性梯度洗脱IgG。W下表格说明纯化性能，其中post-con表 示调节后，post-NP表示纳米粒子后，并且post-CA表示Captoa化ere后。回收率中左侧的 值表示该步骤的回收率，而右侧的值表示先前步骤加该步骤的累积回收率。bid表示检测极 限W下。更多细节请参考Gagnon等人，2014,上述：
[0152]
[0153] 实施例11.通过加入1 %尿囊素、4 %正电性金属亲合性粒子灯REN40 hi曲，Bio-Works)调节含有176, 244ppm宿主蛋白质污染物和19%聚集体的含IgG的细 胞培养采集物，在室溫下混合4小时。被移除的用于分析的样品显示宿主蛋白质被减少到 90, 259ppm并且聚集体被减少到1. 2%。将抑降低到5. 2,加入0. 5%辛酸，并且将混合物解 育2小时。被移除的用于分析的样品显示宿主蛋白质为1，758ppm并且聚集体为约0. 4%。 经由正电性深层过滤器（SartoriusPCI)移除固体。宿主蛋白质被减少到135ppm并且聚 集体被减少到小于0. 05%。通过在抑7. 0的18%阳G-6000中沉淀来纯化抗体。然后用 1.8M硫酸锭洗涂沉淀物W移除PEG,然后将抗体再溶解于50mMH巧es(pH7.0)中。宿主 蛋白质被减少到32ppm。在50mM化is(pH8. 0)下在施加于W空隙排阻模式工作的阴离子 交换色谱柱（UNOsphereQ，Bi〇-Rad)之后，宿主蛋白质被减少到小于1卵m。不同之处仅在 于阳G沉淀在800mM化C1的存在下进行的平行实验将宿主蛋白质减少到小于Ippm。阴离 子交换步骤将宿主蛋白质和聚集体减少到无法检测的水平。R.Nian等人化化romatogr.A 1282(2013) 127-132)描述了空隙排阻模式下的阴离子交换色谱法。
[0154]实施例12.通过加入1 %尿囊素和0. 025%依沙日丫晚调节含有286,OlOppm宿主蛋 白质污染物和23%聚集体的含IgG的细胞培养采集物，并且在室溫揽拌下解育1小时。混 合 1:1:1 粒子混合物（Qielex-100、Mac;roPreptButyUMacroprepHi曲Q，Bi〇-Rad)，将其 平衡到生理条件，并且将沉降的混合粒子W5%的合并量加入到采集物中，然后在室溫下混 合2小时。宿主蛋白质被减少到43, 058ppm并且聚集体被减少到3.4%。在W抑8.0执行 的一系列实验中，通过在独立实验中用PEG-6000沉淀来分级分离样品，在所述独立实验中 的浓度为 600mM、800mM、900mM和lOOOmM(lM)。随后在阳G、50mMl'ris(pH8. 0)中洗涂沉 淀物，此后将抗体再溶解于50mMTris(pH8.0)中。该系列中的宿主蛋白质被分别减少到 51、55、45和41ppm。W5%v/v的量将DowexAGlX2(Bi〇-Rad)形式的阴离子交换粒子加 入到每个样品中，并且混合60分钟。该系列中的宿主蛋白质被减少到16、17、15和13ppm。 执行另一系列的实验，除了初始PEG沉淀在抑7.0下进行之外，所有其它细节都相同。PEG 步骤之后的宿主蛋白质在600mMPfeCl浓度下为44ppm，在800mM浓度下为43ppm，在900mM 浓度下为29ppm，并且在lOOOmM浓度下为31ppm。在Dowex处理之后，宿主蛋白质分别被减 少到 20、17、12 和 16ppm。
[01巧]实施例13.通过加入1 %尿囊素和0.025%依沙日丫晚调节含有286, 01化pm宿主 蛋白质污染物和23%聚集体的含IgG的细胞培养采集物，并且在室溫揽拌下解育1小时。 混合粒子的 1:1:1 :1 混合物（Qielex-lOO,MacroPreptButyl，MacroPrepHi曲Q，购自 Bio-Rad)与正电性金属亲合性粒子灯REN40hi曲，购自Bio-Works)，将其平衡到生理条 件，并且将沉降的混合粒子W5%的合并量加入到采集物中，然后在室溫下混合2小时。宿 主蛋白质被减少到38,Oeippm并且聚集体被减少到1. 4%。在W抑8. 0执行的一系列实验 中，通过在独立实验中用PEG-6000沉淀来分级分离样品，在所述独立实验中化C1的浓度为 600mM、800mM、900mM和lOOOmM(lM)。随后在阳G、50mMTris(pH8. 0)中洗涂沉淀物，此后 将抗体再溶解于50mM化is(pH8.0