蛋白质纯化方法
【专利说明】蛋白质纯化方法
[0001] 巧关申请的声巧
[0002] 本申请要求2013年2月6日提交的美国临时申请号61/761，646、2013年2月 14日提交的61/764, 966、2013年6月4日提交的61/831，099、2013年7月29日提交的 61/859, 772和2013年11月22日提交的61/907, 877的优先权，其各自W全文引用的方式 并入本文中。
【背景技术】
[0003] 重组蛋白的纯化通常从净化步骤开始，其中移除细胞和碎片，使得可W用原本会 因细胞和碎片的存在而受阻碍或变得无效的方法处理剩余上清液。所述移除通常设及 物理方法，例如离屯、和微滤。有时设及使用具有阴离子交换能力的薄膜或深层过滤器， 或直接向含抗体的采集物中加入阴离子交换聚合物或粒子（Gagnon，P.，化rification ToolsforMonoclonalAntibodies,ValidatedBiosystems,Tucson, 1996 ; Kuczewski，M.等人，BiopharmInt. 23 (3H2010) 20-25 ;Kuczewski，M.等人，Biotechnol. J.，6 (201]_) 56-6巧DGan等人化QiromatographyA191 (2013)33-40)最近指出，用可溶形 式和不可溶形式的多价有机离子针对性地移除染色质分解代谢产物特别支持对细胞培养 采集物的有效调节。物理净化方法通常无法实现显著的染色质减少。向采集物中加入阴离 子交换粒子典型地移除大约一半的DM。Gan等人（上文）所描述的一些方法移除99%的 染色质，并且可W精确地被认为是针对染色质的净化方法。
[0004] 已经描述了通过用聚乙二醇（阳G)沉淀来纯化蛋白质。其典型地作为水相技术 来执行，其中PEG溶于水性蛋白质制剂中并且引起蛋白质从该溶液中沉淀出来。PEG的 尺寸和浓度是已知的工艺参数，抑也是一样佑a即〇nl996上文；D.Atha,K.等人J.Biol Chem.，256(1981) 12108-12117 ;美国专利申请公开号2008/0214795,其各自W引用的方式 并入本文中）。操作抑越接近抗体的等电点，实现沉淀所需的PEG浓度就越低。已指出非 蛋白沉淀盐如氯化钢（NaCl)的浓度对选择性几乎没有显著影响（Atha等人，上文），但是 所述技术已经在高达约1. 7M浓度（10% )的化C1的存在下执行（Gervais等人，美国专利 申请公开号2010/0204455)。也已经证实了当PEG与高浓度的化C1组合时，由PEG介导的空 间排阻色谱实现更高的IgG回收率和更低的污染物含量，并且进一步注意到其在很大程度 上抵消了抑的影响化Ga即on等人，J.Qiromatogr,A1324(2014) 171-180)。也已经描述了 将PEG与蛋白质沉淀盐憐酸钢组合（Gervais，上文；美国专利号4, 379, 086和4, 515, 776)。
[0005] 在使沉淀物再溶解之后移除残余PEG对于所述技术来说是一项重大挑战。 Kuczewski等人（上文）通过在其中IgG结合于阳离子交换柱而在PEG流过的条件下进行 阳离子交换色谱来移除残余PEG。阳G的移除原本是复杂的，因为其占据与其被用于沉淀的 蛋白质相同的尺寸范围（作为流体动力学半径或直径测量）。运导致尺寸排阻色谱、透析和 渗滤的标准方法无法用于PEG移除。针对IgG单克隆抗体广泛实施的在流过模式下的阴离 子交换色谱也不适合，因为PEG与抗体一起流过。
【发明内容】
[0006] 在一些方面，本文中公开的实施方案设及用于从蛋白质制剂纯化期望蛋白质的方 法，其包括：通过用可溶性有机多价离子、固定化有机多价离子或两者处理，任选地在过饱 和尿囊素的存在下处理，由此来调节（condition)所述蛋白质制剂，从而移除至少90%的 染色质，然后（1)在大于生理浓度的非蛋白质沉淀盐的存在下用非离子性有机聚合物沉淀 期望蛋白质W提供期望蛋白质的沉淀物，或（2)在不存在大于生理浓度的非沉淀盐的情况 下用非离子性有机聚合物沉淀期望蛋白质W提供沉淀物，随后在大于生理浓度的非蛋白质 沉淀盐的存在下用非离子性有机聚合物洗涂沉淀物，其中沉淀或洗涂步骤任选地在大体上 不存在蛋白质沉淀盐的情况下和任选地在没有将期望蛋白质的抑调节到期望蛋白质的等 电点的0. 5个抑单位W内的值的情况下进行；和任选地在不存在非离子性有机聚合物的情 况下用蛋白质沉淀盐洗涂沉淀物，其中沉淀盐W足够保持期望蛋白质处于沉淀状态的浓度 存在。
【具体实施方式】
[0007] 已经发现，通过在其中90%或更多的染色质和染色质代谢分解产物被移除但是 抗体保持溶解的条件下，使包含抗体的蛋白质制剂接触可溶性有机多价离子和/或固定在 固体表面上的有机多价离子来调节所述包含抗体的蛋白质制剂，运W出乎意料的高程度 提高了PEG沉淀法进行分级分离的能力。例如，在调节步骤使来自宿主蛋白质的污染减 少30-70%时，其惊人地导致随后的PEG沉淀步骤进一步减少宿主蛋白质污染的能力增加 400-500%或更高，尤其当沉淀配方还含有过量的非沉淀盐时。运突出了W下要点，即针对 染色质的净化方法并不是仅仅是通过减少总体污染物负荷、而是通过移除会干扰随后的纯 化步骤的污染物来帮助随后纯化的。还观察到，在沉淀期间存在浓度高于正常生理水平的 盐会显著降低并且在一些情况下实际上消除了将操作抑调节到或使操作抑接近于期望蛋 白质的等电点的需求。用包含浓度足W使蛋白质发生沉淀的蛋白质沉淀盐但不含PEG的最 终洗涂液洗涂所沉淀的期望蛋白质提供了在使期望蛋白质再溶解之前移除PEG的额外优 势。运些特征的各种组合明显地导致调节步骤与沉淀步骤的组合能够将宿主细胞污染降低 到低于通过高性能方法如生物亲和色谱所实现的水平。于是，运允许所公开的方法在抗体 再溶解之后仅经过单个另外的分级分离步骤即可实现足W支持被纯化的期望蛋白质的体 内使用的纯化水平。实验数据证明该集成方法广泛适用于IgG和IgM抗体。其有效地纯化 IgM抗体的能力表明其适用于纯化非抗体蛋白质。本文中所公开的方法的多个方面与国际 专利申请号W0 2013180650、W0 2013180649和W0 2013180655中所公开的方法结合使用， 所述申请各自W全文引用的方式并入本文中。在一个或多个实施方案中，用有机多价离子 调节蛋白质制剂包括使样品与正电性有机添加剂接触。在一些所述实施方案中，正电性有 机添加剂包括选自由依沙日丫晚（ethacridine)、亚甲蓝、十六烷基=甲基漠化锭组成的群组 的至少一种。在一些所述实施方案中，此类物质的浓度或物质组合的总计浓度在0. 001 %到 1 %、或0. 01 %到0. 1 %、或0. 02%到0. 05%的范围。在一些所述实施方案中，制剂的抑可 被调高到不会引起期望蛋白质的回收率明显降低的碱性值。在其中期望蛋白质是IgG单克 隆抗体的一个所述实施方案中，pH可W被调节到比抗体等电点低半个抑单位的抑值，或 者当实验结果表明抗体回收率可接受时被调节到更高，但是所述调节不是必需的。如果在 升高的盐浓度的存在下进行任何抑调节，那么在蛋白质等电点的约0. 5到约1. 0个抑单 位W内、或约1. 5个抑单位W内、或约2. 0个抑单位W内的抑值将是足够的。
[0008] 在一个或多个前述实施方案中，用有机多价离子调节蛋白质制剂包括使样品与负 电性有机添加剂接触。在一些所述实施方案中，负电性有机添加剂包括选自由庚酸、辛酸、 辛締酸、壬酸、壬締酸、癸酸、甲基蓝组成的群组的至少一种。在一些所述实施方案中，此类 物质的浓度或物质组合的总浓度在0. 001 %到10%、或0. 01 %到1 %、或0. 1 %到0. 5%的 范围。在一些所述实施方案中，制剂的抑可被调节降低到不会引起期望蛋白质的回收率明 显降低的酸性值。在一些所述实施方案中，制剂的抑可被调节到3. 5到6. 5、4. 0到6. 0、 4. 5到5. 5、5. 0到5. 3、5. 15到5. 25的范围，或调节到5. 2或另一个中间值。
[0009] 在一个或多个前述实施方案中，正电性多价有机离子和负电性多价有机离子可被 用于调节制剂。在一些所述实施方案中，正电性多价有机离子在负电性多价有机离子之前 接触制剂。在一些所述实施方案中，正电性多价有机离子是约0. 01%浓度的十六烷基=甲 基锭，负电性多价有机多价离子是约0.4%浓度的壬酸。在一些所述实施方案中，可W在调 节的任何阶段存在约1%到约2%的尿囊素。在一些所述实施方案中，经过调节的制剂的聚 集体含量是其中首先加入负电性多价有机离子的制剂中的聚集体含量的大约=分之一到 四分之一。
[0010] 在一个或多个前述实施方案中，用有机多价离子调节蛋白质制剂包括使样品与不 溶解的尿囊素接触。在一些所述实施方案中，存在于蛋白质制剂中的经加入的尿囊素可W 合计为约0. 6%到50%、或0. 7%到20%、或0. 8%到10%、或0. 9%到5%、或1 %到2%、 或中间值。
[0011] 在一个或多个前述实施方案中，用有机多价离子调节蛋白质制剂包括使样品与浓 度低于临界胶束浓度的非离子性或两性离子表面活性剂接触。
[0012] 在一个或多个前述实施方案中，用有机多价离子调节蛋白质制剂包括：（i)提供 第一组分，其是具有负电性表面的第一固体基质；（ii)使蛋白质制剂与第一组分接触，其 中操作条件大体上防止期望蛋白质结合到第一组分上；和（iii)使具有降低的染色质含量 的期望蛋白质与第一组分分离。在一些所述实施方案中，第一负电性表面可W伴随有第二 负电性表面。
[0013] 在一个或多个前述实施方案中，用有机多价离子调节蛋白质制剂包括：（i)提供 第一组分，其是具有正电性表面的第一固体基质；（ii)使蛋白质制剂与第一组分接触，其 中操作条件大体上防止期望蛋白质结合到第一组分上；和（iii)使具有降低的染色质含量 的期望蛋白质与第一组分分离。在一些所述实施方案中，第一正电性表面携带有2(氨乙 基）胺的残基。在一些所述实施方案中，第一正电性表面可W伴随有第二正电性表面。
[0014] 在一个或多个前述实施方案中，用有机多价离子调节蛋白质制剂包括：（i)提供 第一组分，其是具有正电性表面的第一固体基质；（ii)提供第二组分，其是具有负电性表 面的第二固体基质；（iii)使蛋白质制剂与第一组分和第二组分接触，其中第一组分和第 二组分被配置成使得蛋白质制剂可W同时接触运两种组分，其中操作条件大体上防止期望 蛋白质结合到第一组分或第二组分上；和（iv)使具有降低的染色质含量的期望蛋白质与 第一组分和第二组分分离。在一些所述实施方案中，第一正电性表面携带有2 (氨乙基）胺 的残基。
[0015] 在一个或多个前述实施方案中，用有机多价离子调节蛋白质制剂包括：（i)使蛋 白质制剂与包含至少一种结合在表面上的能够结合金属的配体的至少一种固体表面接触， 其中结合在表面上的能够结合金属的配体起初大体上不含金属，其中选择操作条件W大体 上防止期望蛋白质结合到所述至少一种固体表面上，和（ii)使蛋白质制剂与至少一种结 合在表面上的配体分离。
[0016] 在一个或多个前述实施方案中，已经用可溶性的正电性或负电性有机添加剂和/ 或携带有负电性、正电性或金属亲合性配体的固体表面处理的蛋白质制剂可W随后流过某 种装置，该装置的流体接触表面包含正电荷。
[0017] 在一个说明针对染色质的净化方法的应用的实施方案中，W1% (v/v)的量将尿 囊素加入到细胞培养采集物中。细胞培养物可W包含细胞，或者细胞可W预先已经被移除。 加入亚甲蓝，使其浓度为0. 025% (w/v)。或者，可W加入依沙日丫晚，使其浓度为0. 025%。或 者，可W加入十六烷基=甲基漠化锭，使其浓度为0.025%。或者，可W使用0.025%组合浓 度的运些或其它正电性有机添加剂的组合。然后将混合物在揽拌下解育2小时。W2-5% v:v的量加入携带有正电性金属亲合性配体2(氨乙基）胺（TREN)的粒子。将混合物在揽 拌下解育4小时，然后通过任何方便的手段移除固体。包含期望蛋白质的剩余溶液可W任 选地流过深层过滤器，所述深层过滤器在其流体接触表面上携带有正电荷。
[0018] 在另一个说明针对染色质的净化方法的应用的实施方案中，W1% (v/v)的量将 尿囊素加入到细胞培养采集物中。细胞培养物可W包含细胞，或者细胞可W预先已经被移 除。加入0.6%庚酸。或者加入0.4%辛酸。或者加入0.3%壬酸。或者加入0.2%癸酸。 或者加入0.5%甲基蓝。或者，可W使用运些或其它负电性有机添加剂的组合。然后将混合 物在揽拌下解育2小时。W2-5%v:v的量加入携带有正电性金属亲合性配体2 (氨乙基） 胺（TREN)的粒子。将混合物在混合下解育4小时，然后通过任何方便的方法移除固体。包 含期望蛋白质的剩余溶液可W任选地流过深层过滤器，所述深层过滤器在其流体接触表面 上携带有正电荷。
[0019] 在一个或多个前述实施方案中，可W将盐加入到净化混合物中W防止期望