)中。宿主蛋白质分别被减少到79、69、56和57ppm。W 5%v/v的量将DowexAG1X2度io-Rad)形式的阴离子交换粒子加入到每个样品中，并且混 合60分钟。该系列中的宿主蛋白质被减少到18、17、16和13ppm。执行另一系列的实验，除 了初始PEG沉淀在抑7.0下进行之外，所有其它细节都相同。PEG步骤之后的宿主蛋白质 在600mM化C1浓度下为94ppm，在800mM浓度下为62ppm，在900mM浓度下为67ppm，并且在 lOOOmM浓度下为46ppm。在Dowex处理之后，宿主蛋白质分别被减少到28、9、23和17ppm。 [0156]实施例14.通过加入1%尿囊素、0.025%依沙日丫晚和产生25mS/cm的电导率的 化C1调节含有321，48化pm宿主蛋白质和26%聚集体的含IgM的细胞培养采集物。将混合 物解育1小时，通过离屯、移除固体，并且使液体流过填充有相等比例的MacroPrep化11切1、 Macroprep化曲Q、Mac;roprep化曲S和化elex100的柱，其中柱与采集物的体积比为 5%。宿主蛋白质被减少到73, 663ppm并且聚集体被减少到0.8%。在平行但独立的实验中 分级分离样品，运两个独立实验使用抑7的13%阳G-6000,但一个实验使用lOOmM化C1， 另一个实验使用800ml化Cl。然后用13%阳G、50mMH巧es(pH7. 0)洗涂沉淀物W移除过 量的盐，然后将IgM再溶解于50mMH巧es(pH7.0)中。lOOmM化Cl下的宿主蛋白质被减 少到7, 411ppm。800mM化C1下的宿主蛋白质被减少到417ppm。聚集体含量增加到1. 1%。 将样品施加到处于抑7. 0下的阴离子交换块体（CIMQA，BIAS巧arations)并且用氯化钢 梯度洗脱。对应于lOOmM化C1下的阳G沉淀的样品中的宿主蛋白质被减少到l,424ppm。 对应于800mM化Cl下的PEG沉淀的样品中的宿主蛋白质被减少到63ppm。两种制剂中的聚 集体都小于0.01%。
[0157]实施例15.通过辛酸沉淀结合用功能化粒子处理W及随后在800mM化C1下的阳G沉淀来移除污染物。将不同量的辛酸加入到通过离屯、净化的细胞培养采集物中，分别达到 0. 1%、0. 2%、0. 3%、0. 4%和0. 5%的最终浓度。将尿囊素加入到每个样品中达到1%的最 终浓度。既不调节抑也不调节盐浓度。0. 4%辛酸下的最终抑为5. 4。揽拌混合物2小时。 通过使样品穿过0.22ym微量过滤器移除固体。然后使滤液通过含有多孔粒子的等比例 混合物的柱，所述多孔粒子携带有TREN、亚氨基二乙酸和下基配体（分别是购自BioWorks 的WO服邸ADS?TREN40Hi曲、购自Bio-Rad的Chelex-100 和购自Bio-Rad的Macro-Prep T-butyl)，其中粒子的合并体积为所施加的样品体积的5%。宿主细胞蛋白质被从采集物 中最初的1邑6的 242,888口口111减少到0.1%辛酸下的 233,318口口111;0.2%下的 193,400口口111; 0. 3 %下的57, 519ppm;0. 4%下的38, 602ppm;和0. 5 %下的42,666ppm。包括游离的轻链 和轻链二聚体的IgG片段被从采集物中的12. 2%减少到0.3%辛酸下的5.3% ;0. 4%下 的3. 4%;和0.5%辛酸下的3.6%。在0.1和0.2%辛酸下没有片段减少。聚集体被从 采集物中的1. 28%减少到0. 1 %辛酸下的1. 22%、0. 2%辛酸下的0. 87%、0. 3%辛酸下的 0.31%，并且在0.4和0.5%辛酸下无法检测到（小于0.05% )。辛酸浓度下的IgG回收 率为在0. 1 %辛酸下的99%、0. 2%下的99%、0. 3%下的95%、0. 4%下的99%和0. 5%下 的95%。在用多孔粒子的混合物处理之后，在用0.4%辛酸处理的样品中的宿主蛋白质被 减少到4205ppm，表示减少了 98 %，并且得到纯度大于99 %的抗体，其含有1 %片段和无法 测量到的聚集体，总体IgG回收率为99%。通过用聚乙二醇（PEG-6000)沉淀来进一步纯 化抗体，所述沉淀在20. 5%阳G、800mM化Cl、50mMH巧es(pH7. 0)下进行。在用0. 4%辛 酸处理的采集物经过阳G沉淀之后，宿主蛋白质被减少到llppm，聚集体被减少到0. 09%， 并且轻链片段无法检测到。在用0. 5%辛酸处理的采集物经过阳G沉淀之后，宿主蛋白质 被减少到13ppm，聚集体被减少到0. 1%，并且轻链片段无法检测到。运两个结果都对应于 99. 9995%的宿主蛋白质减少。在其中没有用本发明的方法处理采集物的平行对照实验中， 阳G沉淀将宿主蛋白质减少到67, 687ppm。由所公开的方法提供的超过6, 000倍的改良说 明了两个独特的优点。明显的优点是通过本发明的方法减少宿主蛋白质污染允许后续方法 实现宿主蛋白质污染的更多减少。其还突出了W下优点，即所公开的方法尤其移除干扰纯 化方法自身实现其最佳结果的能力的污染物。
[015引本发明的实施方案可W与其它纯化方法组合W实现更高程度的纯化。所述其它纯 化方法的实例包括但不限于通常用于纯化IgG的其它方法，例如蛋白质A和其它形式的亲 和性色谱、阴离子交换色谱、阳离子交换色谱、疏水性相互作用色谱、固定化金属亲和性色 谱和另外的混合模式色谱方法，W及沉淀、结晶和液液萃取的方法。所属领域的普通技术人 员有能力设计用于各种方法的适当条件并且将它们与本文中所公开的方法整合W实现对 特定抗体的必需纯化。
[0159] 本文中引用的所有参考文献都W全文引用的方式并入W用于所有目的，其引用的 程度就如同每个单独公开案或专利或专利申请具体地和单独地被指示成W全文引用的方 式并入W用于所有目的一般。如果通过引用并入的公开案和专利或专利申请与本说明书中 包括的公开内容相矛盾，那么本说明书应当代替和/或优先于任何所述矛盾的内容。
[0160] 在本说明书和权利要求中使用的表示成分数量、色谱条件等的所有数字都被理解 为在所有情况下都由术语"约"修饰。因此，除非相反地指示，否则在本说明书和随附权利 要求中阐述的数字参数是约数，其可W根据想要通过本文中所公开的方法获得的期望性能 而变化。
[0161] 本文中所公开的方法可W作出许多修改和变化而不会脱离其精神和范围，运对于 所属领域的技术人员将是显而易见的。本文中所描述的具体实施方案是仅仅W实例的方式 提供的并且不打算W任何方式构成限制。本说明书和实例应该被理解成仅仅是示例性的， 其中所公开的实施方案的真实范围和精神由下列权利要求指定。
【主权项】
1. 一种用于从蛋白质制剂纯化期望蛋白质的方法，其包括： 通过用可溶性有机多价离子、固定化有机多价离子或两者处理，任选地在过饱和尿囊 素的存在下处理，由此来调节所述蛋白质制剂，从而移除至少90%的染色质，然后 (1) 在大于生理浓度的非蛋白质沉淀盐的存在下用非离子性有机聚合物沉淀所述期望 蛋白质以提供所述期望蛋白质的沉淀物；或 (2) 在不存在大于生理浓度的非沉淀盐的情况下用非离子性有机聚合物沉淀所述期望 蛋白质以提供沉淀物，随后在大于生理浓度的非蛋白质沉淀盐的存在下用非离子性有机聚 合物洗涤所述沉淀物； 其中所述沉淀或洗涤步骤任选地在大体上不存在蛋白质沉淀盐的情况下和任选地在 没有将所述期望蛋白质的PH调节到所述期望蛋白质的等电点的0. 5个pH单位以内的值的 情况下进行；和 任选地在不存在非离子性有机聚合物的情况下用蛋白质沉淀盐洗涤所述沉淀物，其中 所述沉淀盐以足够保持所述期望蛋白质处于沉淀状态的浓度存在。2. 根据权利要求1所述的方法，其中用有机多价离子调节所述蛋白质制剂包括使样品 与正电性有机添加剂接触。3. 根据权利要求2所述的方法，其中所述正电性有机添加剂是选自由以下各项组成的 可溶性阳离子群组中的一种或多种：亚甲蓝、依沙吖啶、氯己定、苯扎氯铵、十六浣基三甲基 溴化铵。4. 根据权利要求2所述的方法，其中所述正电性有机添加剂是选自由因固定在固体表 面上而不可溶的阳离子组成的群组中的一种或多种，所述阳离子包括伯氨基、仲氨基、叔氨 基、季氨基、含有超过一个由一种或多种类型的氨基所赋予的正电荷的配阳离子。5. 根据权利要求2所述的方法，其中所述正电性有机添加剂是固定在固体上的2(氨乙 基）胺（TREN)。6. 根据权利要求1所述的方法，其中用有机多价阳离子调节所述蛋白质制剂包括使样 品与负电性有机添加剂接触。7. 根据权利要求6所述的方法，其中所述负电性有机添加剂是选自由庚酸、辛酸、辛烯 酸、壬酸、壬烯酸、癸酸、甲基蓝组成的可溶性阴离子群组中的一种或多种。8. 根据权利要求6所述的方法，其中所述负电性有机添加剂是选自由因固定在固体 表面上而不可溶的阴离子组成的群组中的一种或多种，所述阴离子包括二氧磷基、羧基、磺 基、含有超过一个由一种或多种类型的带负电基团所赋予的负电荷的配阴离子。9. 根据权利要求6所述的方法，其中所述负电性有机添加剂是亚氨基二乙酸、氮川乙 酸或两者的组合。10. 根据权利要求2或6所述的方法，其中负电性有机添加剂或正电性有机添加剂对金 属离子具有1:1亲合性。11. 根据权利要求1所述的方法，其中如果包含尿囊素，则尿囊素以过饱和浓度存在， 所述过饱和浓度在选自由0. 6到50 %、0. 7到20 %、0. 8到10 %、0. 9到5 %、1到2 %或中间 值组成的群组的范围。12. 根据权利要求1所述的方法，其中所述非离子性有机聚合物是聚乙二醇（PEG)。13. 根据权利要求1所述的方法，其中聚合物尺寸在选自由1000到12, 000道尔顿（D)、 2000到8, 000D、3000到6000D或中间尺寸组成的群组的范围，所述中间尺寸例如为选自由 1500D、3500D、4000D、6000D组成的群组的一个尺寸。14. 根据权利要求1所述的方法，其中所述非蛋白质沉淀盐包括选自由以下各项组成 的群组的一项：乙酸钠、乙酸钾、氯化钠、氯化钾和其组合。15. 根据权利要求1所述的方法，其中将量足以使加入所述非离子性有机聚合物之后 的盐浓度比生理浓度高出在约至少0. 05M到约2.OM范围的增量的所述非蛋白质沉淀盐加 入到经过调节的细胞培养采集物中。16. 根据权利要求1所述的方法，其中在加入所述非离子性有机聚合物的同时，将非蛋 白质沉淀盐的单个盐或非蛋白质沉淀盐的组合加入到细胞培养采集物中以将总盐浓度升 到高于正常的生理盐含量，并且维持过量的非蛋白质沉淀盐。17. 根据权利要求1所述的方法，其中在加入所述非离子性有机聚合物的同时，将所述 非蛋白质沉淀盐加入到蛋白质制剂中，使得最终盐浓度比正常生理浓度高出至少0. 05M的 增量。18. 根据权利要求1所述的方法，其中加入所述非蛋白质沉淀盐以使得所述蛋白质制 剂的净盐浓度高于正常生理值，在选自由200mM到2M、300mM到I. 5M、400mM到lM、500mM到 800mM或中间值组成的群组的范围。19. 根据权利要求1所述的方法，其中在洗涤溶液中包含至少0. 2M浓度的所述非沉淀 盐以维持在所述沉淀物中已经存在的过量。20. 根据权利要求1所述的方法，其中当初始沉淀步骤中不存在所述非沉淀盐时，其被 包括在至少一个洗涤步骤中。21. 根据权利要求1所述的方法，其中可以用一种或多种浓度足以维持所述期望蛋白 质处于沉淀状态的沉淀盐洗涤沉淀物。22. 根据权利要求1所述的方法，其中所述沉淀盐选自由以下各项组成的群组：硫酸 钠、硫酸钾、硫酸铵、磷酸钠、磷酸钾、磷酸铵、柠檬酸钠、柠檬酸钾、柠檬酸铵和其组合。23. 根据权利要求1所述的方法，其中所述期望蛋白质是天然存在的蛋白质、重组蛋 白、抗体、单克隆抗体、IgG抗体或IgM抗体。24. 根据权利要求1所述的方法，其中所述制剂是体液、奶、血浆、血清或细胞培养采集 物。
【专利摘要】一种用于从蛋白质制剂纯化期望蛋白质的方法，其包括：通过用可溶性有机多价离子、固定化有机多价离子或两者处理，任选地在过饱和尿囊素的存在下处理，由此来调节蛋白质制剂，从而移除至少90％的染色质，然后(1)在大于生理浓度的非蛋白质沉淀盐的存在下用非离子性有机聚合物沉淀期望蛋白质以提供期望蛋白质的沉淀物；或(2)在不存在大于生理浓度的非沉淀盐的情况下用非离子性有机聚合物沉淀期望蛋白质以提供沉淀物，随后在大于生理浓度的非蛋白质沉淀盐的存在下用非离子性有机聚合物洗涤沉淀物。
【IPC分类】B01D15/36, C07D279/18, C07C53/126, C01D3/04, C07D219/10, C01D5/00, C07C211/14, C07D233/88, C07C43/10, C07C229/16, C07K1/30
【公开号】CN105026418
【申请号】CN201480007798
【发明人】彼得·斯坦利·加尼翁
【申请人】新加坡科技研究局
【公开日】2015年11月4日
【申请日】2014年2月5日
【公告号】EP2953965A1, WO2014123485A1