抗TNF-α抗原结合蛋白的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及抗TNF抗体的新型变体和这些抗原结合蛋白的制剂。
[0002] 发明背景 在成年哺乳动物中FcRn也称为新生儿Fc受体，通过充当结合并挽救IgG同种型抗体 不被降解的保护性受体在维持血清抗体水平中起重要作用。IgG分子被内皮细胞内吞，并且 如果它们结合FcRn，则被回收出来进入循环。相反，不结合FcRn的IgG分子进入细胞并且 靶向溶酶体途径，在那里它们被降解。
[0003] 新生FcRn受体被认为涉及抗体清除和跨组织的转胞吞作用（参见，JunghansR.P (1997)Immunol.Res16. 29-57和Ghetie等（2000)Annu.Rev.Immunol. 18，739-766)。
[0004]WO9734631公开了包含具有增加的血清半衰期并且在Fc铰链区具有至少一个氨 基酸替换的突变IgG分子的组合物。公开了在选自CH2结构域中编号252、254、256、309、 311或315或CH3结构域中433或434的一个或多个氨基酸处的氨基酸替换。
[0005]W0 00/42072公开了包含具有改变的FcRn结合亲和力的变体Fc区域的多肽，其 中所述多肽在Fc区的下列任意一个或多个氨基酸位置包含氨基酸修饰：Fc区的238、252、 253、254、255、256、265、272、286、288、303、305、307、309、311、312、317、340、356、360、362、 376、378、380、386, 388、400、413、415、424, 433、434, 435、436、439 和 447。
[0006]W0 02/060919公开了包含在下列一个或多个位置含有氨基酸修饰的IgG恒定区 的修饰的IgG:251、253、255、285-290、308-314、385-389 和 428-435。
[0007]W0 2004035752公开了IgG类的修饰的抗体，其中来自重链恒定区的选自氨基酸 残基250、314和428的至少一个氨基酸残基与未修饰的IgG类抗体中存在的不同。
[0008]Shields等（2001，JBiolChem; 276:6591-604)使用丙氨酸扫描诱变以改变 人IgGl抗体的Fc区中的残基并然后评价与人FcRn的结合。当变为丙氨酸时有效废除与 FcRn的结合的位置包括I253、S254、H435和Y436。显示较不显著的结合减少的其它位置如 下：￡233-6236、1?255、1(288、1309、3415和11433。几个氨基酸位置当变为丙氨酸时展示？^?11 结合的改善。
[0009]Dali'Acqua等（2002，JImmunol. ; 169:5171-80)描述了人IgGl铰链-Fc片段 噬菌体展示库相对小鼠FcRn的随机诱变和筛选。他们公开了位置251、252、254-256、308、 309、311、312、314、385-387、389、428、433、434 和 436 的随机诱变。
[0010]W02006130834公开了修饰的IgG，所述IgG包含在下列一个或多个位置含有氨基 酸修饰的IgG恒定区：252、254、256、433、434 和 436。
[0011] 因此，已讨论将IgG抗体的Fc结构域的修饰作为增加治疗性抗体血清半衰期的手 段。但是，很多这些修饰已表明具有变化并且有时相反导致不同的抗体。
[0012] 作为治疗剂的抗原结合蛋白的施用需要以与蛋白的清除率和半衰期特征相关的 规定的频率注射。
[0013] 阿达木单抗是针对TNF-a的单克隆抗体，其用于治疗类风湿性关节炎、银肩病关 节炎、强直性脊柱炎和克罗恩病。其通过使用哺乳动物细胞表达系统的重组DNA技术生产。 其由330个氨基酸组成并且具有约148千道尔顿的分子量。参见美国专利6090382。以0. 5mg/kg(~40mg)的剂量，阿达木单抗的清除率据说是11至15mL/小时的范围，分布体积 (Vss)范围是5-6升，并且平均末期半衰期是约2周（产品特征总结可得自www.medicines, org.uk)。这些半衰期和清除率性质意味着目前的阿达木单抗需要每两周施用一次。在一些 患者中，取决于疾病，可能必须施用负荷剂量（loadingdose)，诸如例如在银肩病患者中。 此剂量可以不同于维持剂量（maintenancedose)〇
[0014] 阿达木单抗难以配制并且需要使用基于柠檬酸的缓冲剂。发明人已经发现本发明 的抗体可以更容易配制入非基于柠檬酸的缓冲剂并且因此可以减少注射部位反应和注射 疼痛的不良作用概况。
[0015] 发明概述 在一个方面，本发明涉及包含TNF-a抗原结合蛋白和组氨酸缓冲剂的液体制剂。在进 一步的方面，所述制剂不包含盐，并且又进一步所述缓冲剂可以包含下列的一种或多种、下 列的组合，或所有下列：表面活性剂、螯合剂、多元醇、抗氧化剂和氨基酸。
[0016] 在一方面，本发明涉及特异性结合TNF-a的包含CDRH1(SEQIDNO: 27)、CDRH2 (SEQIDNO: 28)、CDRH3(SEQIDNo: 29)、CDRL1(SEQIDNO: 30)、CDRL2(SEQIDNO: 31)和⑶RL3(SEQIDNO: 32)的抗原结合蛋白，或其变体，其中所述变体相比⑶RH1、 ⑶RH2、⑶RH3、⑶RL1、⑶RL2或⑶RL3可以含有1、2、3或4个氨基酸替换、插入或缺失；以及 相比人IgGl恒定区包含一个或多个氨基酸替换的人IgGl恒定区的新生儿Fc受体（FcRn) 结合部分。
[0017] 在进一步的方面，所述抗原结合蛋白相比包含SEQIDNo. 2的轻链序列和SEQID No. 12的重链序列的IgG具有增加的在pH6的FcRn结合亲和力和/或增加的半衰期。
[0018] 说明书全文中，术语"人IgGl恒定区"涵盖本领域技术人员已知的所有同种异型 和其变体。
[0019] 在一方面，本发明涉及特异性结合TNF-a的包含CDRH1(SEQIDNO: 27)、CDRH2 (SEQIDNO: 28)、CDRH3(SEQIDNo: 29)、CDRL1(SEQIDNO: 30)、CDRL2(SEQIDNO: 31)和⑶RL3(SEQIDNO: 32)的抗原结合蛋白，或其变体，其中所述变体相比⑶RH1、 ⑶RH2、⑶RH3、⑶RL1、⑶RL2或⑶RL3可以含有1、2、3或4个氨基酸替换、插入或缺失；以及 相比人IgGl恒定区包含一个或多个氨基酸替换的人IgGl恒定区的新生儿Fc受体（FcRn) 结合部分，其中所述抗原结合蛋白相比包含SEQIDNo. 2的轻链序列和SEQIDNo. 12的 重链序列的IgG具有增加的半衰期，并且所述抗原结合蛋白可以每4周施用不超过1次以 实现与通过相同剂量的包含SEQIDNo. 2的轻链序列和SEQIDNo. 12的重链序列的IgG 每两周施用1次所实现的相当的平均稳态谷浓度。
[0020] 在一方面，本发明涉及特异性结合TNF-a的包含CDRH1(SEQIDNO: 27)、CDRH2 (SEQIDNO: 28)、CDRH3(SEQIDNo: 29)、CDRL1(SEQIDNO: 30)、CDRL2(SEQIDNO: 31)和⑶RL3(SEQIDNO: 32)的抗原结合蛋白，或其变体，其中所述变体相比⑶RH1、 ⑶RH2、⑶RH3、⑶RL1、⑶RL2或⑶RL3可以含有1、2、3或4个氨基酸替换、插入或缺失；以 及相比人IgGl恒定区包含一个或多个氨基酸替换的人IgGl恒定区的FcRn结合部分，其中 所述抗原结合蛋白相比具有相同的CDR而无这些修饰的抗TNF抗原结合蛋白在pH6具有 2倍，或3倍，或4倍，或5倍，或6倍，或8倍或更多的对于FcRn的亲和力，如在25°C通过 ProteOnXPR36蛋白相互作用阵列系统所评价，所述阵列系统具有固定化在芯片上的抗原 结合蛋白。
[0021] 在一个方面，本发明涉及抗原结合蛋白，其是包含SEQIDNo. 2的轻链序列和SEQ IDNo. 12的重链序列的IgG的变体，其中所述抗原结合蛋白变体在IgG恒定区的Fc受体 (FcRn)结合部分包含一个或多个替换，以增加抗原结合蛋白变体相比不含这些替换的IgG 的半衰期，其中当所述变体以40mg的单一剂量，以每4-8周的间隔施用给患者时，患者群 体中的平均稳态谷浓度在给药间隔之间不落到4|ag/mL以下或不落到5|ag/mL以下。优选 地，患者群体中的平均血清谷抗体浓度在给药间隔之间不落到6yg/mL以下。优选地，当 所述变体以40mg的单一剂量以每8周间隔施用给患者时，患者群体中的平均血清谷抗体浓 度在给药间隔之间不落到5yg/mL以下。优选地，当所述变体以40mg的单一剂量以8周 间隔施用给患者时，患者群体中的平均血清谷抗体浓度在给药间隔之间不落到4yg/mL以 下，同时仍然提供最佳功效。优选地，当所述变体以40mg的单一剂量以每8周间隔施用给 患者时，患者群体中的平均血清谷抗体浓度在给药间隔之间不落到3yg/mL以下，同时仍 然提供最佳功效。
[0022] 在一个方面，本发明涉及用于治疗疾病的如本文公开的抗原结合蛋白，其中所述 抗原结合蛋白可以施用给患者每4周不超过一次，以实现与通过相同剂量的包含SEQID No. 2的轻链序列和SEQIDNo. 12的重链序列的IgG每两周施用1次所实现的相当的平 均稳态谷浓度。
[0023] 在一个方面，本发明涉及治疗具有疾病的患者的方法，所述方法包括施用根据本 发明的抗原结合蛋白。
[0024] 在一个方面，本发明涉及编码根据本发明的抗原结合蛋白或其部分诸如重或轻链 的核酸序列。在一个方面，本发明涉及编码根据本发明的抗原结合蛋白或其部分诸如重或 轻链的表达载体。
[0025] 在一个方面，本发明涉及包含编码根据本发明的抗原结合蛋白的核酸序列的宿主 细胞。在一个方面，本发明涉及用于在治疗银肩病或类风湿关节炎中使用的根据本发明的 抗原结合蛋白。
[0026] 在一个方面，本发明涉及试剂盒，所述试剂盒包含本发明的抗原结合蛋白，并且任 选地包含氨甲喋呤用于根据本发明的抗原结合蛋白与氨甲喋呤的伴随递送。
[0027] 在一个方面，本发明涉及用于治疗早已用氨甲喋呤治疗的个体中类风湿关节炎的 如本文公开的抗原结合蛋白，并涉及与氨甲喋呤组合用于治疗类风湿关节炎的抗原结合蛋 白，其中所述组合同时、基本同时或顺序递送。
[0028] 在一个方面，本发明涉及用于治疗早已用氨甲喋呤治疗的个体中银肩病的如本文 公开的抗原结合蛋白，并涉及与氨甲喋呤组合用于治疗银肩病的抗原结合蛋白，其中所述 组合同时、基本同时或顺序递送。
[0029] 附图简述 图1--抗TNFa抗体与人TNFa的结合 图2-一加速的应激研究后抗TNFa抗体与人TNFa的结合活性的分析 图3--在25%人血清中孵育2周后抗TNFa抗体与人TNFa的结合 图4--冻融后抗TNFa抗体与人TNFa的结合 图5--抗TNFa抗体对FcyRIIIa受体（a)结合人FcyRIIIa(缬氨酸158变体）（b) 结合人FcyRIIIA(苯丙氨酸158变体）的分析 图6--BPC2604在雌性食蟹猴和pascolizumab在雄性食蟹猴中在单次静脉内注射（1小时输注）后平均剂量标准化的血浆浓度 图7--主要峰稳定性研究。 图8--Tm失稳。 图9--Tm稳定性研究 图10 (A)物理稳定性[cIEF]:与热稳定性非线性相关。 图10 (B)化学稳定性[SEC]: 图10 (C)热力学/构象稳定性[DSC]: 图11--与NaCl的稳定性情况。
[0030] 发明详述 在一个方面，本发明涉及包含TNF-a抗原结合蛋白和组氨酸缓冲剂的液体制剂。
[0031] 在本发明的一个方面，所述液体制剂包含如本文所述的TNF-a抗原结合蛋白。
[0032] 在进一步的方面，本发明涉及特异性结合TNF-a的新型抗原结合蛋白。特别是， 本发明涉及抗TNF抗体诸如阿达木单抗的新型变体，其相比阿达木单抗显示增加的对FcRn 受体的结合和/或增加的半衰期。阿达木单抗是包含SEQIDNo. 2的轻链序列和SEQID No. 12的重链序列的IgG单克隆抗体。
[0033] 发明人已经发现如本文所述的对阿达木单抗的特定修饰显示在FcRn结合中特别 的改善，如下面实施例所示。阿达木单抗的亲和力成熟的变体显示抗TNF-a结合和/或中 和活性方面的改善。
[0034] 本发明的新型抗原结合蛋白具有增加的对FcRn受体的结合和/或增加的半衰期 和/或增加的平均滞留时间和/或减少的清除率。认为结合FcRn导致更长的体内血清保 留。为了增加Fc蛋白的体内保留，在约pH6观察到结合亲和力的增加。在一个方面，本发 明因此提供了具有优化的对FcRn的结合的抗原结合蛋白。
[0035] 在一个方面，本发明的抗原结合蛋白的半衰期相比包含SEQIDNo. 2的轻链序列 和SEQIDNo. 12的重链序列的IgG增加2-6倍，诸如2倍、3倍、4倍、5倍或6倍。优选地， 本发明的抗原结合蛋白的半衰期相比包含SEQIDNo. 2的轻链序列和SEQIDNo. 12的重 链序列的IgG增加3倍、4倍或更多。例如如果IgG是具有10天或10-20天范围的半衰期 的阿达木单抗，则在一个实施方案中，本发明的抗原结合蛋白显示约40-80天的半衰期。例 如，抗原结合蛋白包含选自SEQIDN0:5或SEQIDN0:9或SEQIDN0:15或SEQIDN0:18 或SEQIDNO:21 或SEQIDNO:24 或SEQIDNO:163 或SEQIDNO:165 或SEQIDNO:167 或SEQIDNO: 169的重链序列。
[0036] 在一个实施方案中，本发明的抗原结合蛋白在患者中施用每4周不超过一次，实 现约2yg/mL至约7yg/mL之间的平均稳态谷浓度。优选地，所述平均稳态谷浓度是约 4yg/mL至约7yg/mL之间，并且更优选约5yg/mL至约6yg/mL之间? 在一个实施方案中，本发明的抗原结合蛋白在患者中施用每28天不超过一次，实现约 2iig/mL至约7iig/mL之间的平均稳态谷浓度。优选地，所述平均稳态谷浓度是约4yg/ mL至约7yg/mL之间，并且更优选约5yg/mL至约6yg/mL之间。
[0037] 在本发明的一个实施方案中，本发明的抗原结合蛋白可以每4、5、6、7或8周施用 1次以实现与通过阿达木单抗当以相同剂量每两周施用一次实现的平均稳态谷浓度相当的 平均稳态谷浓度。
[0038] 在本发明的所有方面的优选实施方案中，本发明的抗原结合蛋白可以每7或8周 施用一次。
[0039] 在本发明的一个实施方案中，本发明的抗原结合蛋白可以每25-80天，例如每 40-60天，或例如每28、35、42、49或56天施用一次以实现与通过阿达木单抗当以相同剂量 每14天施用一次实现的平均稳态谷浓度相当的平均稳态谷浓度。
[0040] 在本发明的一个实施方案中，所述抗原结合蛋白可以每49-60天，例如每56天施 用一次。
[0041] 在本发明的所有方面的一个实施方案中，所述抗原结合蛋白在pH6具有2倍，或4 倍，或6倍，或8倍或更多的对于人FcRn的亲和力，如在25°C通过ProteOnXPR36蛋白相 互作用阵列系统所评价，其中所述抗体固定化在芯片上。优选地，所述抗原结合蛋白对于人 FcRn具有约100至约500KD(nM)之间，诸如约130至约360KD(nM)之间，或约140至约 250KD(nM)之间，或约140至约210KD(nM)之间的亲和力。
[0042] 在一个实施方案中，所述抗原结合蛋白的清除率为约2至约10mL/小时，优选约2 至约5mL/小时或2至4mL/小时，或2至3mL/小时，诸如约2、约2. 5、3、4或5mL/小时。在 一个实施方案中，本发明的抗原结合蛋白显示比阿达木单抗低2倍、3倍、4倍或5倍的清除 率。在一个实施方案中，对于根据本发明的抗原结合蛋白的清除率是在上文规定的范围或 比约40mg人剂量的阿达木单抗低2倍、3倍、4倍或5倍。
[0043] 在一个方面，本发明抗原结合蛋白是阿达木单抗(包含SEQIDNo. 2的轻链序列 和SEQIDNo. 12的重链序列的IgG)的变体，所述变体在IgG恒定区的FcRn结合部分包 含一个或多个替换，以增加所述变体相比阿达木单抗的半衰期，其中当所述变体以40mg的 单一剂量，以每4-8周的间隔优选每8周间隔施用给患者时，患者群体中的平均稳态谷浓度 不落到5|ag/mL以下。在一个实施方案中，患者群体中的平均稳态谷抗体浓度在给药间隔之 间不落到6yg/mL以下。
[0044] 在一个进一步的实施方案中，所述抗原结合蛋白在所述抗原结合蛋白的Fc区包 含至少一个氨基酸修饰，其中所述修饰相比阿达木单抗序列中相同位置在Fc区的250、 252、254、256、257、259、308、428或434位中的一个或多个，其中Fc区中的氨基酸编号是 Kabat中的EU索引。
[0045]野生型人IgGl在位置 308-314 具有氨基酸残基Val-Leu-His-Gln-Asp-Trp-Leu， 在位置251-256具有氨基酸残基Leu-Met-Ile-Ser-Arg-Thr，在位置428-436具有氨 基酸残基Met-His-Glu-Ala-Leu-His-Asn-HisTyr，在位置385-389具有氨基酸残基 Gly-Gln-Pro-Glu-Asn。对于IgG2_4,残基编号可以不同。
[0046] 在一个实施方案中，本发明的抗原结合蛋白相比包含SEQIDNo. 13序列的人 IgGl恒定区包含一个或多个氨基酸替换。
[0047] 在一个实施方案中，人IgGl重链恒定区的FcRn结合部分中一个或多个氨基酸替 换是在根据Kabat的EU索引编号的氨基酸残基252、254和256,并且在残基252的aa替 换是用tyr、phe、tryp或thr替换met ;在残基254的aa替换是用thr替换ser ;并且在 残基256的aa替换是用ser、arg、glu、asp或thr替换thr。优选地，在残基252的aa替 换是用thr替换；在残基254的aa替换是用thr替换，并且在残基256的替换是用glu替 换。优选地，IgGl恒定区如SEQIDNo: 7所示。
[0048] 在一个实施方案中，人IgGl恒定区的FcRn结合部分中一个或多个氨基酸替换是 在根据Kabat的EU索引编号的氨基酸残基250和428,并且在残基250的aa替换是用glu 或gin替换thr;在残基428的aa替换是用leu或phe替换met。优选地，在残基250的aa 替换是用glu替换，并且在残基428的替换是用leu替换。优选地，IgGl恒定区如SEQID No: 16所示。
[0049] 在一个实施方案中，人IgGl恒定区的FcRn结合部分中一个或多个氨基酸替换是 在根据Kabat的EU索引编号的氨基酸残基428和/或434。优选地，在残基428的aa替换 是用leu替换met，并且在残基434的替换是用ser替换asn。优选地，IgGl恒定区如SEQ IDNo: 10 所示。
[0050] 在一个实施方案中，人IgGl恒定区的FcRn结合部分中一个或多个氨基酸替换是 在根据Kabat的EU索引编号的氨基酸残基259或308。优选地，在残基259的替换是用ile 替换val，并且在残基308的aa替换是用phe替换val。优选地，IgGl恒定区如SEQIDNo: 19 或SEQIDNo: 22 所示。
[0051] 在一个实施方案中，人IgGl重链恒定区的FcRn结合部分中一个或多个氨基酸替 换是如SEQIDNo: 25所示，在根据Kabat的EU索引编号的氨基酸残基257或434。
[0052] 在一个实施方案中，人IgGl重链恒定区的FcRn结合部分中一个或多个氨基酸 替换是在根据Kabat的EU索引编号的氨基酸残基433或434,例如所述残基是H433K和 N434F。优选地，IgGl恒定区如SEQIDNo: 165 或SEQIDNo: 167 所示。
[0053] 在一个实施方案中，所述抗原结合蛋白包含表A中所列的任意IgGl恒定区修饰。
[0054] 在一个实施方案中，所述抗原结合蛋白是抗体。
[0055]