一种安全快速鉴定食品中猪源性成分的检测方法及其试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种食品检测方法，具体地说是一种安全快速鉴定食品中猪源性成分 的检测方法及其试剂盒，属于食品检测方法领域。
【背景技术】
[0002] 随着经济的发展和人民生活水平的提高，对牛、羊肉的市场需求将不断扩大，近年 来一些不法分子为了谋取高额利润，在市场上出现一些在牛、羊肉中掺杂猪肉的假牛、羊肉 等冷冻肉卷及肉片造假产品，还出现了一些以猪头肉、猪瘦肉，佐以八角、桂皮、花椒等调料 一同熬成的"假肉汤"。这些以猪肉冒充牛、羊肉、以假充真、掺杂使假的违法行为，仅靠肉 组织的形态学检查已不能满足对肉产品种属鉴定的需要。为更好保护新疆、宁夏以及周边 中亚地区等地少数民族的风俗习惯，对其清真食品的食用安全提供保障，确保我国的社会 稳定；故建立一种安全有效、准确、迅速鉴定各类制品中猪源性成分的检测方法成为当务之 急。
[0003] 目前分子生物学技术已越来越多地用于肉源种属的鉴定，具有重复性好、灵敏度 高等优点，并可以克服形态学鉴定中主观性强等缺点。16SrRNA基因进化速度适中，遗传 信息丰富，同时随着分子生物学技术的发展，DNA序列数据库也日益增长，在GenBank中已 经积累了大量相关的序列信息资源，成为生物检材种属鉴定的基础。本发明即采用mtDNA 16SrRNA基因序列直接测序的方法，实现对各类制品中猪源性成分的鉴定。
【发明内容】
[0004] 为了解决上述问题，本发明设计了一种安全快速鉴定食品中猪源性成分的检测方 法及其试剂盒，利用线粒体DNA基因测序方法对各类制品中的猪肉源性进行分析鉴定，结 果准确、灵明度高，能快速检测食品中所含的猪肉成分，不但杜绝了以猪肉冒充牛、羊肉、以 假充真、掺杂使假的违法行为，也对新疆、宁夏和其周边的中亚地区等少数民族聚居区清真 食品的食用安全提供了保障，也为我国社会的稳定提供了可靠的技术支持。
[0005] 本发明的技术方案为： 一种安全快速鉴定食品中猪源性成分的检测方法，具体包括以下步骤： (1) 设计引物：设计只能扩增猪线粒体DNA的猪特异性引物，所述特异性引物包括上游 引物和下游引物两种，其序列如下： 上游引物F:5-ATGAAACAITGGAGTAGTCCTACTAITTACC-3 ; 下游引物R:5-CTACGAGGTCTGITCCGATATAAGG-3 ; (2) 模板DNA提取：采用酚-氯仿法提取模板DNA，并于质量分数0. 8%的琼脂糖电泳进 行检测，提取的模板DNA于-20°C备存； (3) PCR扩增引物及反应体系：反应总体系25uL，包括12. 5uL的PCRMix，2. 5pmol/L 的步骤（1)制备的上游引物和下游引物各IUL，步骤（2)提取的模板DNA50~100ng，水补 余； (4)PCR扩增：在步骤（3)的条件下，依次进行预变性95°C、4min，变性94°C、45s，退火、 猪特异性引物60°C、30s，延伸72°C、60s，连续进行35个循环，最后延伸72°C、7min，得到模 板DNA即mtDNA的16SrRNA基因片段； (5) 扩增产物检测：将步骤（4)猪特异性引物扩增mtDNA得到的16SrRNA基因片段， 用质量分数1. 5%的琼脂糖电泳检测，将扩增后得到的基因片段进行序列测定，并根据测序 结果进行同源性匹配判断。
[0006] 其中，所述 12. 5uL的PCRMix包括PCR缓冲液 10UL，2. 5mmol/L的dNTPs 2. 0UL，5U/UL的Taq酶 0? 5UL。
[0007] -种安全快速鉴定食品中猪源性成分的检测试剂盒，包括特异性引物、DNA提取试 剂、PCRMix以及水，所述的四种物质混合后即得到PCR反应体系混合液的总体积为25uL， 其中，所述特异性引物包括上游引物和下游引物，上游引物和下游引物各IuL;所述DNA提 取试剂包括A溶液、B溶液、C溶液、D溶液、E溶液五部分，每克检测样本需Iml的A溶液； 所述PCRMix的用量为12. 5ul;水补余。
[0008] 所述PCR反应体系混合液中PCR Mix为总混合液体积的0. 5倍；上游引物和下游 引物各为混合液总体积的1/25, ；DNA总量为50-100ng ;如果上述成分体积加起来不足总体 积，不足的部分用水补足即可。
[0009] 另外，所述检测试剂盒中还可以含有琼脂糖，用于检测样本在提取模板DNA后来 进行琼脂糖电泳检测，以及特异性引物扩增模板DNA既mtDNA得到的16SrRNA基因片段进 行琼脂糖电泳检测，所述琼脂糖每次检测用量为3克。
[0010] 其中，所述的上游引物和下游引物的序列如下： 上游引物F: 5-ATGAAACAITGGAGTAGTCCTACTAITTACC-3， 下游引物R: 5-CTACGAGGTCTGITCCGATATAAGG-3 ; 所述DNA提取试剂的构成包括A溶液、B溶液、C溶液、D溶液、E溶液五部分；其中， A溶液：200 U g/ml的蛋白酶K ;10mmol/L的pH8.0的Tris - Cl ;0? lmol/L的pH8.0的EDTA ;质量分数0.5%的SDS ;20 ii g/ml的RNase A ;用量为每克样本加入Iml ; B溶液：平衡酚，并用0. 5mmol/L的Tris-Cl饱和，pH8. 0 ;用量为A溶液体积的0. 5 倍； C溶液：氯仿/异戊醇，体积比为24 : 1 ; D溶液：冷无水乙醇AR; E溶液：TE缓冲液，lOmmol/L的Tris-Cl、lmol/L的pH8. 0 的EDTA; 所述PCRMix包括PCR缓冲液 10UL，2. 5mmol/L的dNTPs2. 0UL，5U/UL的Taq酶 0. 5uL； 所述琼脂糖粉即琼脂糖ME。
[0011] 上述检测试剂盒的使用方法如下： (一)、DNA提取试剂的使用： (1) 将待检测样本剪碎，每克样本加入Iml的A溶液，涡旋振荡30秒后，室温放置5分 钟，并12000rpm离心3分钟，取上清液； (2) 将步骤（1)得到的上清液加入B溶液，颠倒混匀，12000rpm离心3分钟，取上清液； (3) 将步骤（2)得到的上清液加入等体积的C溶液，颠倒混匀，12000rpm离心3分钟， 取上清液； (4) 将步骤（3)得到的上清液加入Iml溶液D，颠倒混匀，12000rpm离心3分钟，弃去上 清后，剩余加入E溶液即可得到基因组DNA溶液即模板DNA; (二)、将PCRMix用移液器吸取12. 5ul，将上游引物和下游引物各用移液器吸取lul，以 及步骤(一）制备的模板DNA50~lOOng，混合，水补余，得到PCR反应体系混合液25uL; (三）PCR扩增：将步骤(二）的PCR反应体系混合液，依次进行预变性95 °C、4min，变 性94°C、45s，退火、猪特异性引物60°C、30s，延伸72°C、60s，连续进行35个循环，最后延伸 72°C、7min，得到mtDNA的 16SrRNA基因片段； (四)扩增产物检测：将步骤(三)特异性引物扩增mtDNA得到的16SrRNA基因片段，进 行序列测定，并根据测序结果进行同源性匹配判断。
[0012] 另外，所述步骤(一）得到的模板DNA还可以用琼脂糖电泳检测；所述步骤（四）得 至_特异性引物扩增模板DNA即mtDNA得到的16SrRNA基因片段可以用琼脂糖电泳进行 检测，所述琼脂糖每次检测用量为3克。琼脂糖每次用量天平称取3克，加入30ml水，用微 波炉煮沸熔解后，倒入制胶器即可。
[0013]本发明通过猪特异性引物检测时，含猪源性成分的样本可检出猪特异性阳性条 带，即可判定为此肉制品中含有猪源性成分。为了验证结果的可靠性，可进一步进行测序和 同源性查询比较，若样本16SrRNA基因序列与猪同源性达到95%以上，可确认上述判定。
[0014]本发明能够简单有效、迅速的实现对各类肉制品中含有的猪源性成分进行准确鉴 定，通过本发明的引物及反应体系，运用琼脂糖电泳检测能准确检测各制品中的猪源性成 分；检出率99. 7%，最低检出限lug/kg，一次能够处理48个样本，完成检测只需4个小时，检 测的速度和准确度也大大提高，为快速检测鉴定猪源性成分提供了技术保障。
[0015]本发明的优点在于：结果准确、灵敏度高，能快速检测食品中所含的猪肉成分，不 但杜绝了以猪肉冒充牛、羊肉、以假充真、掺杂使假的违法行为，也对新疆、宁夏和其周边的 中亚地区等少数民族聚居区清真食品的食用安全提供了保障，也为我国社会的稳定提供了 可靠的技术支持。
[0016] 下面结合附图和实施对本发明作进一步说明。
【附图说明】
[0017] 图1为本发明实施例3模板DNA的琼脂糖电泳图； 图2为本发明实施例3扩增后16SrRNA基因片段的琼脂糖电泳图。
【具体实施方式】
[0018] 以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用 于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
[0019] 除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为重量百分数。
[0020] 实施例1 一种安全快速鉴定食品中猪源性成分的检测方法，具体包括以下步骤： (1)设计引物：设计只能扩增猪线粒体DNA的猪特异性引物，所述特异性引物包括上游 引物和下游引物两种，其序列如下： 上游引物F:5-ATGAAACAITGGAGTAGTCCTACTAITTACC-3 ; 下游引物R:5-CTACGAGGTCTGITCCGATATAAGG-3 ; (2) 模板DNA提取：采用酚-氯仿法提取模板DNA，并于质量分数0. 8%的琼脂糖电泳进 行检测，提取的模板DNA于-20°C备存； (3) PCR扩增引物及反应体系：反应总体系25uL，包括12. 5uL的PCRMix，2. 5pmol/L 的步骤（1)制备的上游引物和下游引物各IUL，步骤（2)提取的模板DNA50~100ng，水补 余； (4)PCR扩增：在步骤（3)的条件下，依次进行预变性95°C、4min，变性94°C、45s，退火、 猪特异性引物60°C、30s，延伸72°C、60s，连续进行35个循环，最后延伸72°C、7min，得到模 板DNA即mtDNA的16SrRNA基因片段； (5) 扩增产物检测：将步骤（4)猪特异性引物扩增mtDNA得到的16SrRNA基因片段， 用质量分数1. 5%的琼脂糖电泳检测，将扩增后得到的基因片段进行序列测定，并根据测序 结果进行同源性匹配判断。
[0021] 其中，所述 12. 5uL的PCRMix包括PCR缓冲液 10UL，2. 5mmo