一种检测白血病干细胞是否存在的试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及白血病诊断试剂盒，更具体地讲，涉及利用新发现的干细胞程序开发 检测白血病干细胞是否存在的试剂盒。
【背景技术】
[0002] 现普遍认为白血病复发的主要原因是由于现有的治疗方法无法清除体内的白血 病干细胞（leukemicpropagatingcells,LPCs)，检测LPCs是否存在是判断白血病预后的 重要途径。目前只有功能实验（如移植给免疫缺陷小鼠）才能判断LPCs的存在，但是实验 要求苛刻、耗时很长，不利于临床应用。目前也没有确实的细胞表面分子可以检测LPCs。
[0003] 作为干细胞，LPCs有自我更新能力和一定的分化能力，相应地，LPCs-定有干细 胞程序（包括自我更新所需程序）。因此本发明根据功能已知的诸基因设计了一个造血干 细胞（hematopoieticstemcell,HSC)程序，利用普通的定量PCR技术检测该程序基因在白 血病细胞的表达谱，就可以快速准确地判定LPCs是否存在，并因此判断病人的预后。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的第一个技术问题是，提供一种检测白血病干细胞是否存在的试 剂盒。
[0005] 本发明所要解决的第二个技术问题是，提供HSCB程序在制备检测白血病干细胞 是否存在的试剂盒中的应用。
[0006] 为了解决上述第一个技术问题，本发明提供了一种检测白血病干细胞是否存在的 试剂盒，其特征在于，所述试剂盒通过检测造血干细胞程序即HSCB程序来检查白血病干细 胞的存在，所述HSCB程序包含以下基因：H0XB4、BMII、TEL、AMLl、PTEN、IKZFl、MLL、GFI1、 TCF3、EBF1、SPI1、IKZFl、DNTT、PAX5、VPREBl、RAGl/2、LEFl和IGLLl。
[0007] 作为一个优选方案，所述试剂盒包含以下引物（SEQIDNO. 1 -SEQIDNO. 36):
[0044] 为了解决上述第二个技术问题，本发明提供了HSCB程序在制备检测白血病干细 胞是否存在的试剂盒中的应用，其特征在于，所述HSCB程序包含以下基因：H0XB4、BMI1、 TEL、AMLl、PTEN、IKZFl、MLL、GFII、TCF3、EBFl、SPII、IKZFl、DNTT、PAX5、VPREBl、RAG1/2、 LEFl和IGLLl。
[0045] 本发明的优点在于，本发明设计的干细胞程序，即HSCB程序能忠实地反映造血细 胞的全转录组，判定造血细胞群的干性特征和分化阶段。检测HSCB在白血病细胞的表现并 与正常细胞群进行比较，如果白血病细胞在HSCB的表现接近正常造血干细胞和/或早期祖 细胞，就可以判断LPC的存在，预示病人的预后差。本发明所设计的试剂盒检测方便，准确 可靠，可以广泛用于白血病的诊断，检测LPCs是否存在和判断病人的预后。
【附图说明】
[0046] 图IHSCB程序的设计和在正常脐带（CB)血细胞的表现。A，HSC向B细胞分化的 模式图和各个阶段的调控基因，这些基因组成了HSCB程序。B，用流式分选仪分选不同的细 胞群。C，定量PCR检测HSCB程序各基因在不同细胞群中的表达。D，生物信息学聚类分析 HSCB程序在不同细胞群中的分布和相互关系。
[0047] 图2HSCB程序在ALL白血病细胞群中的表现和与正常细胞群的比较。A，ALL细胞 群的分选。B，定量PCR检测HSCB程序基因在ALL细胞群中的表达谱。C，聚类分析HSCB程 序在各个ALL细胞群中的分布和相互关系。D，PCA分析HSCB程序在正常CB细胞群中的分 布和相互关系。E，PCA分析HSCB程序在ALL细胞群中的分布和相互关系。F，用PCA方法 比较ALL细胞群与正常CB细胞群之间的关系。G，根据PCA分析，计算ALL细胞群与CB各 细胞群之间差异。
【具体实施方式】
[0048] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无 特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途 径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例 中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0049] 实施例I.HSCB程序的发现和应用
[0050] 1 ?设计HSCB程序。
[0051] 1)选择调控HSC自我更新的基因
[0052] 根据文献报道，如下基因已经被功能实验证实是调控HSC自我更新所必需的基 因：H0XB4、BMI1、TEL(或称为ETV6)、AMLl(或称为RUNX1)、PTEN、IKZF1、MLL和GFIl(图 IA) 〇
[0053] 2)选择调控B细胞发育的基因
[0054] 从HSC发育到成熟的B细胞要经过早期淋巴祖细胞（ELPCP)、Pro_B祖细胞、Pre-B 祖细胞、不成熟和成熟B细胞（IM/M-B)。
[0055] 根据文献报道，如下基因已经被功能实验证实是调控B细胞发育不同阶段所必需 的基因：TCF3、EBFl、SPIl、IKZFl、DNTT、PAX5、VPREBl、RAGl/2、LEFl和IGLLl(图 1A)。
[0056] 3)将上述两方面的基因组成一个程序
[0057] 本发明将其命名为HSCB程序（HSCBprogram,图1A)。
[0058] 2.从正常脐带血分离不同造血细胞群，检测HSCB程序在这些细胞群中的表达谱。
[0059] 1)取正常脐带血（cordblood,CB)，用梯度离心法分离单个核细胞（mononuclear cell，MNC)，用免疫磁珠法分离⑶34+细胞。
[0060] 2)按如下干祖细胞的特异性表面标记，用流式分选仪分选各个干细胞群（图 IB) ：
[0061]HSC，CD34+CD38CD19;
[0062] ELPCP，CD34+CD38+CD19 ;
[0063] Pro-B，CD34+CD38+CD19+;
[0064]Pre-B，CD34CD19+IgM;
[0065] 頂/M-B，CD34CD19+IgM+。
[0066] 3)利用定量Real-timePCR检测HSCB程序组成基因的表达量，重复3次实验，统 计结果如图IC所示。所用引物系列分别为（SEQIDNO. 1 -SEQIDNO. 36):
[0067]H0XB4:正向引物 5' -TGAGCACGGTAAACCCCAATTACG-3，；
[0068]反向引物 5' -AGAGCGCGTGGGCGATCTC-3，；
[0107]聚类分析结果显示（图ID)，HSCB程序在各个细胞群聚集非常好，并且从HSC到 IM/M-B依序排列。用PCA(principlecomponentsanalysis)方法分析也进一步证明了这一 结果（图2D)。这些结果说明：①HSCB程序可以在细胞群水平进行检测分析；②HSCB程序 可以很好代表整个转录组；③HSCB程序可以作为干细胞程序来检查白血病LPCs的存在。
[0108] 4.分离11例病人白血病细胞各个相应细胞群，检测HSCB程序在这些细胞群中的 表达谱。
[0109] 1)我们收集了 11例急性淋巴细胞性白血病（acutelymphoblastic leukemia,ALL)的白血病细胞。用梯度离心方法分离单个核细胞。用流式细胞分析仪分 离与正常细胞相对应的细胞群（图2A)，因为我们和其他研究组已经报道这些细胞群含有 LPCs：
[0110]ALL特异性的细胞群（ALL-SP)，CD34+CD38CD19+);
[0111] ALL-Pro-B，CD34+CD38+CD19+;
[0112] ALL-Pre-B，CD34CD38+CD19+ ;