l/L的dNTPs 2. 0UL，5U/UL的Taq酶 0? 5UL。
[0022] 实施例2 一种安全快速鉴定食品中猪源性成分的检测试剂盒，包括特异性引物、DNA提取试剂、PCRMix以及水，所述的四种物质混合后即得到PCR反应体系混合液的总体积为25uL，其 中，所述特异性引物包括上游引物和下游引物，上游引物和下游引物各IuL;所述DNA提取 试剂包括A溶液、B溶液、C溶液、D溶液、E溶液五部分，每克检测样本需Iml的A溶液；所 述PCRMix的用量为12. 5ul;水补余。
[0023] 所述PCR反应体系混合液中PCRMix为总混合液体积的0. 5倍；上游引物和下游 引物各为混合液总体积的1/25, ；DNA总量为50-100ng;如果上述成分体积加起来不足总体 积，不足的部分用水补足即可。其中，PCRMix即PCR缓冲液组成为：Tris-HCl(pH8. 3)， 100mM；KCl,500mM；MgC12,15mM； 另外，所述检测试剂盒中还可以含有琼脂糖，用于检测样本在提取模板DNA后来进行 琼脂糖电泳检测，以及特异性引物扩增模板DNA既mtDNA得到的16SrRNA基因片段进行琼 脂糖电泳检测，所述琼脂糖每次检测用量为3克。琼脂糖每次用量天平称取3克，加入30ml 水，用微波炉煮沸熔解后，倒入制胶器即可。
[0024] 其中，所述的上游引物和下游引物的序列如下： 上游引物F: 5-ATGAAACAITGGAGTAGTCCTACTAITTACC-3， 下游引物R: 5-CTACGAGGTCTGITCCGATATAAGG-3 ; 所述DNA提取试剂的构成包括A溶液、B溶液、C溶液、D溶液、E溶液五部分；其中， A溶液：200Ug/ml的蛋白酶K;10mmol/L的pH8. 0 的Tris-Cl;0?lmol/L的pH8. 0 的EDTA;质量分数0. 5%的SDS;20iig/ml的RNaseA;用量为每克样本加入Iml;注：样本在 0.lg-1.Og之间，A液加入量为Iml;lg以上的样本，倍比增加A液的用量，例如：1. 5g样本 加入1，5mlA液，2.Og样本加入2mlA液，依次类推。一般建议取样量不超过lg。 B溶液：平衡酚，并用0. 5mmol/L的Tris-Cl饱和，pH8. 0 ;用量为A溶液体积的0. 5 倍。
[0025]C溶液：氯仿/异戊醇，体积比为24 :I;用量与其相反应的液体的体积相同； D溶液：冷无水乙醇AR;用量为Iml; E溶液：TE缓冲液，lOmmol/L的Tris-Cl、lmol/L的pH8. 0 的EDTA;用量为 50-200ul。
[0026] 所述PCRMix包括PCR缓冲液 10UL，2. 5mmol/L的dNTPs2. 0UL，5U/UL的Taq 酶 0? 5UL; 所述琼脂糖粉即琼脂糖ME。
[0027] 实施例3 上述实施例2检测试剂盒的使用方法如下： (一) 、DNA提取试剂的使用： (1) 将待检测样本剪碎，每克样本加入Iml的A溶液，涡旋振荡30秒后，室温放置5分 钟，并12000rpm离心3分钟，取上清液至新的离心管中； (2) 将步骤（1)得到的上清液（500ul-800ul)加入500ul的B溶液，颠倒混匀， 12000rpm离心3分钟，取上清液至新的离心管中； (3) 将步骤（2)得到的上清液加入等体积的C溶液(用量为步骤（2)所得上清的相同体 积，例如：步骤（2)离心后所得上清为300ul，则加入C液为300ul)，颠倒混匀，12000rpm离 心3分钟，取上清液至新的离心管中； (4) 将步骤（3)得到的上清液(一般为C溶液加入量的0. 5倍)加入Iml溶液D，颠倒混 匀，12000rpm离心3分钟，弃去上清后，剩余加入IOOul的E溶液即可得到基因组DNA溶液 即模板DNA。
[0028] 基因组DNA经核算蛋白定量仪定量，A260/280比值为1. 7-2. 0为合格，具体见下 表1 :
(二)、配制PCR体系：将PCRMix用移液器吸取12. 5ul，将上游引物和下游引物各用移 液器吸取Iul，以及步骤(一)制备的模板DNA50~lOOng，混合，水补余，得到PCR反应体系 混合液25uL;具体见下表2 :
(三）PCR扩增：将步骤(二）的PCR反应体系混合液，依次进行预变性95°C、4min，变 性94°C、45s，退火、猪特异性引物60°C、30s，延伸72°C、60s，连续进行35个循环，最后延伸 72°C、7min，得到mtDNA的 16SrRNA基因片段； (四)扩增产物检测：将步骤(三)特异性引物扩增mtDNA得到的16SrRNA基因片段，进 行序列测定，并根据测序结果进行同源性匹配判断。
[0029] 另外，所述步骤(一)得到的模板DNA用琼脂糖电泳进行质检，合格的DNA条带明亮 而单一，无任何污染，结果如图1所示； 所述步骤（四)得到的特异性引物扩增模板DNA即mtDNA得到的16SrRNA基因片段用 琼脂糖电泳进行质检，结果如图2所示，具有亮带的为含猪源性成分的样本，无亮带的为不 含猪源性成分的样本； 琼脂糖电泳的具体操作为称取3克琼脂糖，加入30ml水，微波炉煮沸熔解，倒入制胶 槽，待冷却后，将得到的PCR产物加入琼脂糖胶的点样孔中，120V，20mim，凝胶成像仪观察 并成像。
[0030] 实施例4 试验表明：采用本发明的方法，经过实验室累计检测各种含猪肉样本1568份，实际检 出1566份，检出率99. 7%，最低检出限：lug/kg 且一次能够处理48个样本，完成检测只需4个小时，检测的速度快，准确度高，为快速 检测鉴定猪源性成分提供了技术保障。
【主权项】
1. 一种安全快速鉴定食品中猪源性成分的检测方法，其特征在于，具体包括以下步 骤： (1) 设计引物：设计只能扩增猪线粒体DNA的猪特异性引物，所述特异性引物包括上游 引物和下游引物两种，其序列如下： 上游引物 F:5-ATGAAACAITGGAGTAGTCCTACTAITTACC-3 ; 下游引物R :5-CTACGAGGTCTGITCCGATATAAGG-3 ; (2) 模板DNA提取：采用酚-氯仿法提取模板DNA，并于质量分数0. 8%的琼脂糖电泳进 行检测，提取的模板DNA于-20°C备存； (3) PCR扩增引物及反应体系：反应总体系25uL，包括12. 5uL的PCR Mix，2. 5pmol/L 的步骤（1)制备的上游引物和下游引物各I U L，步骤（2)提取的模板DNA50~100ng，水补 余； (4) PCR扩增：在步骤（3)的条件下，依次进行预变性95°C、4min，变性94°C、45s，退火、 猪特异性引物60°C、30s，延伸72°C、60s，连续进行35个循环，最后延伸72°C、7min，得到模 板DNA即mtDNA的16S rRNA基因片段； (5) 扩增产物检测：将步骤（4)猪特异性引物扩增mtDNA得到的16S rRNA基因片段， 用质量分数1. 5%的琼脂糖电泳检测，将扩增后得到的基因片段进行序列测定，并根据测序 结果进行同源性匹配判断。2. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述12. 5uL的PCR Mix包括PCR缓 冲液 10 U L，2. 5mmol/L 的 dNTPs 2. 0 U L，5U/ U L 的 Taq 酶 0? 5 U L。3. -种安全快速鉴定食品中猪源性成分的检测试剂盒，其特征在于：包括特异性引 物、DNA提取试剂、PCR Mix以及水，所述的四种物质混合后即得到PCR反应体系混合液，所 述PCR反应体系混合液中PCR Mix为总混合液体积的0. 5倍；所述特异性引物包括上游引 物和下游引物，上游引物和下游引物各为混合液总体积的1/25, ；DNA总量为50-100ng ;如 果上述成分体积加起来不足总体积，不足的部分用水补足即可。4. 根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于：PCR反应体系混合液的总体积为 25uL，其中，所述的上游引物和下游引物各IuL ;所述DNA提取试剂包括A溶液、B溶液、C溶 液、D溶液、E溶液五部分，每克检测样本需Iml的A溶液；所述PCR Mix的用量为12. 5ul ; 水补余； 其中，A溶液：200 u g/ml的蛋白酶K ;10mmol/L的 pH8.0的Tris - Cl ;0? lmol/L的 pH8.0的EDTA ;质量分数0?5% 的SDS ;20Ug/ml的RNase A ; B溶液：平衡酚，并用0. 5mmol/L的Tris-Cl饱和，pH8. 0 ; C溶液：氯仿/异戊醇，体积比为24 : 1 ; D溶液：冷无水乙醇AR ; E 溶液：TE 缓冲液，lOmmol/L 的 Tris - Cl、lmol/L 的 pH8. 0 的 EDTA。5. 根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒中还可以含有琼 脂糖，用于检测样本在提取模板DNA后来进行琼脂糖电泳检测，以及特异性引物扩增模板 DNA既mtDNA得到的16S rRNA基因片段进行琼脂糖电泳检测，所述琼脂糖每次检测用量为 3克。6. 根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于：所述的上游引物和下游引物的序 列如下： 上游引物F: 5-ATGAAACAITGGAGTAGTCCTACTAITTACC-3， 下游引物R: 5-CTACGAGGTCTGITCCGATATAAGG-3。7.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于：所述B溶液用量为A溶液体积 的0. 5倍，C溶液用量与其相反应的上清液的体积相同，D溶液用量为lml，E溶液用量为 50_200ul〇
【专利摘要】本发明公开了一种安全快速鉴定食品中猪源性成分的检测方法及其试剂盒，检测方法包括设计猪特异性引物、模板DNA提取、PCR扩增引物及反应体系制备、PCR扩增以及扩增产物检测等步骤，所述试剂盒包括特异性引物探针、DNA提取试剂、PCR反应体系混合液以及琼脂糖粉等成分；本发明的优点在于：结果准确、灵明度高，能快速检测食品中所含的猪肉成分，不但杜绝了以猪肉冒充牛、羊肉、以假充真、掺杂使假的违法行为，也对新疆、宁夏和其周边的中亚地区等少数民族聚居区清真食品的食用安全提供了保障，也为我国社会的稳定提供了可靠的技术支持。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105087764
【申请号】CN201410207247
【发明人】张超, 刘军, 陈慕芝, 焦谊, 闻娅, 雷蕊
【申请人】乌鲁木齐欧易生物医学科技有限公司
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2014年5月16日