Dna三向节活化的杂交链式反应用于dna甲基化转移酶的高灵敏检测的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及酶活性检测领域，具体涉及DNA三向节活化的杂交链式反应用于DNA甲基化转移酶的高灵敏检测，尤其涉及DNA甲基化转移酶M.SssI的检测。
【背景技术】
[0002]在过去十几年里，DNA因其具有严格的碱基配对原则而成为一种有趣的组装元素用于可控的、程序化的设计和组装DNA纳米材料。通过合理的序列设计和DNA自组装过程，一系列的动态DNA纳米器件被成功组装，如纳米机器、逻辑门、催化放大器等，它们大多是基于Toehold介导的链置换反应。DNA纳米器件通常是通过pH的调节、核酸杂交以及金属离子与碱基的反应引发的。然而，一般的设计仅仅将一种目标物转化为信号输出，这大大限制了目标物响应的DNA纳米器件的多样化设计。
[0003]典型的DNA三向节是由三条单独的DNA互相杂交形成，它作为一种新型的DNA纳米组装构筑单元被应用于DNA动态自组装中。多臂结构为组装目标物响应的DNA纳米器件提供了更多的可能性。对Toehold介导的链置换反应而言，在不同的三向节臂上安置Toehold和链迀移序列是至关重要的，原因为该种设计可使组装更加灵活，反应更易调节。在DNA三向节活化策略中，最初Toehold序列和链迀移序列是不可接近的，当进行识别反应后，通过某种信号转导机制的引入，即可将该识别事件转化为三向节的活化过程。最近，DNA三向节活化策略被成功用于目标物诱导的DNA环路和逻辑门中。然而，在该类设计中仍存在诸多限制，Toehold和链迀移序列通过一段完整的适体链连接或被劈开成两条DNA链，这就只能依赖指定的识别机制构建DNA纳米器件，如适体与蛋白质的绑定、金属与特定碱基对的结合等。因此，构建功能先进且能识别多种目标物的DNA纳米器件仍是个巨大的挑战。
[0004]核酸酶，如DNA修饰酶，在调节基因表达和维持基因完整性上起重要作用。DNA修饰酶的异常表达可能干扰基因形式的遗传外重新编程进而影响核染色质结构，引起许多疾病，如癌症、亨廷顿疾病或精神异常等。然而，DNA修饰酶作用的底物为一段DNA序列或特定的碱基位点，利用DNA修饰酶构建DNA纳米器件的最大障碍即为缺少有效的识别机制，如何将该类酶的作用转化为DNA三向节活化过程，是本领域技术人员面临的难题。
【发明内容】
[0005]为解决上述现有技术存在的问题，发明人通过引入新的酶识别机制，可以实现将不同种目标物转化为同一种信号输出的一般性纳米器件的构建。以DNA甲基化转移酶M.SssI为模型，开发了在DNA三向节活化中引入酶保护切割识别机制，将DNA修饰酶对底物的作用转化为杂交链式反应的触发过程，从而引起DNA的自组装过程，并实现了通用性DNA纳米器件的构建。该器件能够用于DNA修饰酶(尤其是DNA甲基化酶)的高灵敏检测和抑制剂筛选，证明了该方法具有潜在的应用价值。
[0006]本发明涉及以下技术方案:
[0007]1、一种杂交链式反应方法，包括由DNA修饰酶参与的DNA三向节活化形成DNA三向节触发链，进而引发发卡结构H1、H2的杂交链式反应，其特征在于，DNA修饰酶识别探针可被限制性内切酶切割无法作为触发链引发杂交链式反应，DNA修饰酶与DNA修饰酶识别探针作用引入限制性酶酶切保护机制，DNA修饰酶的作用使得限制性内切酶识别位点发生变化，使其无法被该限制性内切酶切割，继而作为DNA三向节触发链引发杂交链式反应。
[0008]具体的，本发明所述引入限制性酶酶切保护机制，优选的实施例为，DNA修饰酶识别探针由一条携带Toehold部分的DNA链与一条携带链迀移部分的DNA链直接退火形成，Toehold部分和链迀移部分是相互靠近的，其茎部包含可同时被限制性内切酶和DNA修饰酶作用的识别位点，识别探针与DNA修饰酶作用后，探针茎部序列发生变化，限制性内切酶识别位点消除，识别探针不能被限制性内切酶切割，保持探针的原构象，继而引发后续的杂交链式反应，未经DNA修饰酶作用的探针，不能阻止限制性内切酶对其茎部的切割，造成Toehold部分和链迀移部分的分离，破坏引发链的完整性，DNA动态自组装过程不能进行。
[0009]本领域技术人员明了，不同类型的DNA修饰酶可以通过不同的方式使得识别序列发生碱基变化，如针对DNA甲基化转移酶M.SssI，识别探针由一条携带Toehold部分的DNA链与一条携带链迀移部分的DNA链直接退火形成，Toehold部分和链迀移部分是相互靠近的，其茎部包含同时可被限制性内切酶HpaII和M.SssI作用的识别位点，识别探针与M.SssI作用后，甲基化的胞嘧啶阻止HpaII的切割，能够保持识别探针的原构象，进而可以引发后续的杂交链式反应，而未甲基化的探针则不能阻止HpaII对其茎部的切割，造成Toehold部分和链迀移部分的分离，破坏了引发链的完整性，因此DNA动态自组装过程不能进行。
[0010]2、一种基于DNA三向节活化杂交链式反应的DNA甲基化转移酶检测方法，其特征在于，
[0011](I)制备DNA甲基化转移酶识别探针、H1、H2，其中DNA甲基化转移酶识别探针由一条携带Toehold部分的DNA链与一条携带链迀移部分的DNA链直接退火形成，Toehold部分和链迀移部分是相互靠近的，其茎部包含可同时被限制性内切酶和DNA甲基化转移酶作用的识别位点，识别探针与DNA甲基化转移酶作用后，探针茎部序列发生变化，限制性内切酶识别位点消除，识别探针不能被限制性内切酶切割，保持探针的原构象，继而引发后续的杂交链式反应，未经DNA甲基化转移酶作用的探针，不能阻止限制性内切酶对其茎部的切割，造成Toehold部分和链迀移部分的分离，破坏引发链的完整性，DNA动态自组装过程不能进行；
[0012](2)加入步骤(I)识别探针所对应的DNA甲基化转移酶和限制性内切酶，进行杂交链式反应；
[0013](3)对反应结果进行信号检测。
[0014]优选的，上述检测方法在DNA甲基化转移酶与识别探针作用前，进行DNA的退火，包括DNA甲基化转移酶识别探针、杂交链式反应的Hl和H2的退火，使Hl和H2均形成稳定的非活化状态发夹结构，DNA甲基化转移酶识别探针由分别携带toehold和链置换部分的两条单链退火形成。
[0015]优选的，杂交链式反应中形成的双链在每个H2的末端都会形成一个G-四倍体结构，作为信号报告元件，通过加入荧光染料NMM进行信号检测。
[0016]优选的，DNA甲基化转移酶为M.SssI，其对应使用的限制性内切酶为Hpall。
[0017]优选的，识别探针的序列为CCTT GCA ATT CCGGA TAC TCT ATT，AAT AGA GTA TCCGG TTT AC AA CGAA CACG TTACC ;H1 的序列为 ACM CGAA CACG TTACC GGGTA GGGCG TTAGGAGGTA ACGT GTTC GTTG TAAT TGCA AGG, H2 的序列为 TGGGT TCCTAA CGCCC TACCC GGTAACGTGT TCGTT GT GCAATT ACAA CGAA CACG TTACC GGTA GGCG GG。
[0018]3、一种利用上述检测方法进行DNA甲基化转移酶抑制剂/拮抗剂筛选的方法，其特征在于:在步骤(2)中，额外加入不同浓度的候选抑制剂后，进行杂交链式反应。
[0019]4、一种基于DNA三向节活化的杂交链式反应的DNA甲基化转移酶检测试剂盒，其特征在于，包括DNA甲基化转移酶识别探针、H1、H2，信号检测试剂，其中DNA甲基化转移酶识别探针由一条携带Toehold部分的DNA链与一条携带链迀移部分的DNA链直接退火形成，Toehold部分和链迀移部分是相互靠近的，其茎部包含可同时被限制性内切酶和DNA甲基化转移酶作用的识别位点，识别探针与DNA甲基化转移酶作用后，探针茎部序列发生变化，限制性内切酶识别