实时荧光pcr和探针法融解曲线结合的多重核酸检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及多重核酸检测探针和检测方法，具体涉及一种实 时荧光PCR和探针法融解曲线技术相结合的多重核酸检测探针和检测方法。本发明还涉及 所述探针或方法用于多重核酸检测的用途。
【背景技术】
[0002] 自实时荧光定量PCR(Real-timePCR)技术发明以来，该技术通过实时监测杂交探 针释放的荧光信号，能够定性或者定量检测样本中的核酸。由于其具备灵敏度高、特异性 强、污染少等特点，在核酸检测领域得到了广泛的应用。
[0003] 融解曲线（meltingcurve)技术主要运用染料法或者探针法对PCR终产物进行定 性检测或者分析。其中，染料法主要通过在PCR终产物中加入饱和或者半饱和染料，该染料 能和产物的双链DNA结合并发光，根据产物Tm值不同形成不同的融解峰。探针法融解曲线 主要利用荧光标记的探针和PCR终产物进行杂交，探针和产物杂交时会释放荧光信号；不 同荧光基团标记的探针代表不同的检测项，并且也以探针和产物杂交时的Tm值对应的融 解峰判断阴阳性；探针法融解曲线技术可用于核酸定性检测，主要应用核酸突变方面的检 测，因为探针的Tm值会随不同的碱基突变而有所变化，形成不同融解峰，这样就可以根据 融解峰的Tm值的不同具体判断突位点。
[0004] 多重荧光PCR技术是指利用实时荧光定量PCR技术、在同一反应体系内用多对引 物及探针扩增一种或多种不同扩增子的检测方法。由于其具备灵敏度高、特异性强、污染 少、快捷及节约成本等优点，已成为目前该领域的主要研究及应用热点。但本技术受到检测 设备通道数目限制，目前的多重荧光定量PCR仪检测样本数至多为四个或五个。如果能实 现在现有设备通道基础上扩大检测样本数目，那么将能够进一步节约时间、降低成本、提高 效率和扩大应用范围。
【发明内容】
[0005] 本发明通过将实时荧光PCR和探针法融解曲线技术相结合，实现了核酸的实时检 测分析和终点分析相结合，使在同一反应体系内可检测的样本数能够达到基于实时荧光 PCR技术可检测的样本数的两倍，由此完成了本发明。
[0006] 本发明第一方面涉及基于探针法融解曲线技术进行多重核酸检测的探针，其特征 在于该探针不能被DNA聚合酶水解，并且该探针与核酸结合的退火温度比同一反应体系中 实时荧光PCR的探针与核酸结合的退火温度低3_20°C。
[0007] 根据本发明第一方面任一项的探针，其中所述核酸为DNA或RNA。
[0008] 根据本发明第一方面任一项的探针，其中所述DNA聚合酶具有5'_3'外切酶活性。
[0009] 根据本发明第一方面任一项的探针，其5'端的五碳糖、碱基或者报告荧光基团被 基团修饰，所述基团例如为氨基、硫基、甲基或生物素等。
[0010] 根据本发明第一方面任一项的探针，所述探针与核酸结合的退火温度比同一反应 体系中荧光PCR探针与核酸结合的退火温度低5-15°C。
[0011] 在本发明的实施方案中，所述探针与核酸结合的退火温度比同一反应体系中实时 荧光探针与核酸结合的退火温度低12°c。
[0012] 在本发明中，降低探针与核酸结合的退火温度的方法为本领域所公知，例如，缩短 探针的长度、改变核酸的碱基组成或者引入突变位点。
[0013] 在本发明中，通过引入突变位点降低探针与核酸结合的退火温度的方法为本领域 所公知，例如正常引入一个A/T的突变，Tm值变化在2°C左右，引入一个G/C的突变，Tm值 变化在4 °C左右。
[0014] 根据本发明第一方面任一项的探针，所述探针的长度为10_40bp，例如为 16_21bp。
[0015] 在本发明的实施方案中，所述融解曲线探针的长度为20bp。
[0016] 本发明第二方面涉及基于探针法融解曲线技术进行多重核酸检测的反应体系，其 包含本发明第一方面任一项的探针。
[0017] 根据本发明第二方面任一项的反应体系，其中所述的探针个数与该检测设备的检 测通道个数相匹配，例如当检测通道为4个时，则探针可以为1-4个，当检测通道为5个时， 探针可以为1-5个。
[0018] 根据本发明第二方面任一项的反应体系，其还包含相应的待测样本、引物等。
[0019] 本发明第三方面涉及多重PCR反应体系，其包括基于实时荧光PCR技术的反应体 系以及本发明第二方面任一项的基于探针法融解曲线技术进行多重核酸检测的反应体系。
[0020] 在本发明中，基于实时荧光PCR技术的反应体系为本领域所公知。
[0021 ] 在本发明的实施方案中，所述实时荧光PCR技术为实时荧光PCR探针技术，例如为 Taqman探针实时荧光PCR。
[0022] 本发明第四方面涉及基于实时荧光PCR和探针法融解曲线技术相结合的多重核 酸检测方法，所述检测方法包括使用本发明第一方面任一项的探针、第二或第三方面任一 项的反应体系的步骤。
[0023] 根据本发明第四方面任一项的检测方法，所述方法包括以下步骤：
[0024](1)在基于实时荧光PCR的基本反应体系中，另外加入一种或多种待测核酸样本， 以及与该待测核酸样本对应的一个或多个本发明第一方面任一项的探针；
[0025] (2)同时设定实时荧光PCR反应程序，以及探针法融解曲线反应程序，所述融解曲 线反应程序的起始温度与本发明第一方面任一项的探针的退火温度相比，低3-20°C，例如 低 5-15。。；
[0026] (3)待反应程序结束后，对得到的基于实时荧光PCR技术的扩增曲线和基于探针 法融解曲线技术的融解曲线进行分析。
[0027] 根据本发明第四方面任一项的检测方法，其中所述实时荧光PCR技术为实时荧光 PCR探针技术，例如为Taqman探针实时荧光PCR。
[0028] 根据本发明第四方面任一项的检测方法，其中步骤（1)中所述的另外加入的核酸 样本数或本发明第一方面任一项的探针的个数最多与同一反应体系中基于实时荧光PCR 技术可检测的样本数或探针数相同。
[0029] 根据本发明第四方面任一项的检测方法，其中步骤（1)的基本反应体系中还含有 引物、实时荧光PCR探针及其它实时荧光PCR或探针法融解曲线技术所必需的成分。
[0030] 根据本发明第四方面任一项的检测方法，其中步骤（1)中的本发明第一方面任一 项的探针还连接有报告荧光基团，当该探针的数目为多个（例如为2、3、4、5个）时，这些探 针之间的报告荧光基团不同。
[0031] 根据本发明第四方面任一项的检测方法，其中所述的融解反应程序为：从比本发 明第一方面任一项的探针与核酸的退火温度低5_15°C开始（即起始温度），逐渐升温至 90-99°C，每秒钟升温0.rc左右。
[0032] 在本发明的实施方案中，所述融解曲线反应程序中的起始温度与的探针的退火温 度相比低TC左右。
[0033] 在本发明的实施方案中，所述融解反应程序为40°C(即起始温度）升温到95°C， 每秒钟升温〇.rc，全程收集荧光信号。
[0034] 根据本发明第四方面任一项的检测方法，其中所述核酸为DNA或RNA。
[0035] 根据本发明第四方面任一项的检测方法，该方法可用于检测2-10种核酸类型。
[0036] 在本发明的实施方案中，基于实时荧光PCR技术和探针法融解曲线技术检测的核 酸类型个数各为一个。
[0037] 本发明第五方面涉及本发明第一方面任一项的探针、第二或第三方面的反应体系 或第四方面任一项的检测方法用于检测核酸的用途。
[0038] 根据本发明第五方面任一项的用途，其中所述的核酸为DNA或RNA。
[0039] 在本发明的实施方案中，所述检测核酸是指定性检测核酸。
[0040] 在本发明的实施方案中，所述检测核酸是指用于检测多重核酸，例如为检测2-