10 种核酸类型。
[0041] 在本发明中，所述实时荧光探针技术属于实时荧光定量PCR的一种，实时荧光PCR 探针（例如Taqman)是一种寡核苷酸探针，它的荧光与目的序列的扩增相关。它设计为与 目标序列上游引物和下游引物之间的序列配对。荧光基团连接在探针的5'末端，而淬灭剂 则在3'末端。当完整的探针未与目标序列配对时，荧光基团发射的荧光因与3'端的淬灭 剂接近而被淬灭。但在进行延伸反应时，聚合酶的5'外切酶活性将探针进行酶切，使得荧 光基团与淬灭剂分离。实时荧光PCR探针适合于各种耐热的聚合酶，如DyNAzymeTMIIDNA 聚合酶等。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累，因此荧光强度与扩增产 物的数量呈正比关系。在本发明中，所述基于实时荧光PCR技术的反应体系即是指基于上 述技术的反应体系，也称为扩增反应体系、扩增曲线反应体系或者扩增曲线技术。
[0042] 在本发明中，所述多重实时PCR是指在同一个反应中实现两个或更多核酸序列的 扩增和特异性检测的实时PCR，其可用于生成定性或定量的结果。
[0043] 在本发明中，与单一实时PCR相比，在进行多重实时PCR时的反应体系或需要注意 的问题等为本领域所公知。
[0044] 在本发明中，所述扩增曲线是指在实时荧光PCR过程中随着扩增循环数的增加， 释放出来的荧光基团信号不断积累所形成的S型曲线。
[0045]在本发明中，所述融解曲线（也有称为熔解曲线或溶解曲线）是在融解曲线反应 程序中，在逐渐增加温度的同时监测荧光信号的变化，经计算机自动形成以荧光信号强度 的负导数为纵坐标，温度为横坐标的所形成的曲线。当有待测核酸产物存在时，会在融解曲 线探针的Tm处产生融解峰，而无待测核酸产物存在时，则不存在该融解峰。
[0046] 在本发明中，所述实时突光PCR技术或基于实时突光PCR技术的反应体系均为本 领域所公知，例如该反应体系中包括模板、引物、探针、dNTP、DNA聚合酶、缓冲液、Mg2+或Mn2+ 等，这些组分的选择、浓度的设定以及反应程序等均为本领域所公知。
[0047] 在本发明中，所述DNA聚合酶通常为耐高温热启动DNA聚合酶，其具有5'-3'外切 酶活性。
[0048] 在本发明中，基于传统的实时荧光PCR技术的反应体系，同时利用探针法融解曲 线技术对核酸进行多重定量或定性检测。在本发明的具体实施方案中，在实时荧光PCR反 应体系中，同时加入适于融解曲线检测的探针、引物，并设置相应的融解曲线反应程序，实 现了实时荧光PCR技术和融解曲线技术的同步检测。
[0049] 在本发明中，所述Tm值或退火温度可以在实验前通过软件例如DNAMAN、 Primer5. 0等计算得到。
[0050] 在本发明中，所述Tm值和退火温度之间的关系为本领域所公知，例如退火温度通 常比Tm值低5 °C。
[0051] 在本发明中，如果未特别说明，所述探针均连接有报告荧光基团。
[0052] 在本发明中，所述融解曲线反应体系中探针的报告荧光基团与基于实时荧光PCR 技术的报告荧光基团相同或不同，例如为FAM、ROX、VIC/HEX、CY3、CY5。在本发明的实施方 案中，融解曲线反应体系中的荧光基团可以与扩增曲线反应体系中的荧光基团相同，但融 解曲线反应体系的不同探针之间的荧光基团应该不同。
[0053] 在本发明中，所述核酸为DNA或RNA。在本发明的实施方案中，所述核酸为微生物 的核酸，例如为细菌、真菌、病毒或支原体的核酸。在本发明的具体实施方案中，所述微生物 为人丙肝病毒和人免疫缺陷病毒。
[0054] 在本发明中，根据实时荧光PCR技术的扩增曲线判断核酸检测结果的方法为本领 域所公知。
[0055] 在本发明中，根据融解曲线判断核酸检测结果的依据为有无融解峰。不同荧光通 道代表不同的检测项，阳性在其对应的Tm值处会有融解峰，阴性则无融解峰。
[0056] 本发明通过将实时荧光PCR和探针法融解曲线技术相结合，实现了核酸实时检测 分析和终点分析的结合，使每一种技术均有多个通道可选择，每一技术都有各自的判定方 法，且两种技术间、不同通道间彼此不相互干扰，同样具备实时荧光探针法的灵敏度及特异 性，其可检测的样本数量最高可达到基于实时荧光PCR技术的两倍，从而可实现高通量、高 灵敏度及高特异性的多重PCR检测。
[0057] 在本发明的实施方案中，用不同的荧光基团代表不同检测项，用融解峰的有无判 断阴阳性，可更好的防止假阳性的出现。
【附图说明】
[0058] 图IHCV单重实时荧光扩增曲线（上）及融解曲线（下）结果 [0059]图2HIV单重实时荧光扩增曲线（上）及融解曲线（下）结果 [0060] 图3HIV单重融解曲线探针扩增曲线（上）及融解曲线（下）结果
[0061] 图4同时含有HCV实时荧光探针（上）及HIV融解曲线探针（下）扩增结果
[0062] 图5三种不同体系的HIV融解曲线特异性
【具体实施方式】
[0063] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会 理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体 条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为 可以通过市购获得的常规产品。
[0064] 实施例1
[0065] 实验流程：
[0066]I. 1:引物及探针的设计
[0067] 针对HCV的5 '端和HIV的Gag保守区设计了HCV和HIV引物及探针，并将HIV的 实时荧光探针改造为融解曲线探针。两种探针都为FAM标记。其中HIV的融解曲线探针的 5'端做氨基修饰，即以磷酸二酯键的方式和FAM的荧光基团相连接（宝生物工程（大连） 有限公司）。引物及探针的序列见表1。
[0068] 表1各引物及探针序列
[0069]
[0070] 注：HCV基因序列号：M67463,HIV的基因序列号：NC-001802
[0071] 1. 2:模板的提取及稀释：按照核酸提取试剂盒（北京金麦格生物技术有限公司， 试剂目录号为NA007-2)说明书、提取已知浓度的HCV阳性、HIV阳性和HCV与HIV混合阳 性样本及临床阴性血浆（样本由厦门大学提供）的RNA，将提取的阳性样本依次梯度稀释到 I. 0X103IU/ml简（称E3)、I. 0X102IU/ml(简称E2)、I. 0XIO1IlVml(简称El)。
[0072] 1. 3:体系的配制：按照引物及探针浓度分别配制如下4种体系：
[0073] (I)HCV实时荧光单重体系：50ill扩增体系内含有dNTP终浓度为IOmM;rTth 酶（东洋纺（上海）生物科技有限公司货号Tth-329)使用量为2. 5U;Mn(AcO)2终浓度 为2. 5mM;模板20ill;HCV-F终浓度为0? 7iiM，HCV-R终浓度为0? 7iiM，HCV-P终浓度为 0. 2uM；
[0074] (2)HIV实时荧光单重体系：50ill扩增体系内含有dNTP终浓度为IOmM;rTth 酶（东洋纺（上海）生物科技有限公司货号Tth-329)使用量为2. 5U;Mn(AcO)2终浓度 为2. 5mM;模板20 ;HIV-F终浓度为0. 7iiM，HIV-R终浓度为0. 7Mm,HIV-P终浓度为 0. 2uM；
[0075] (3)HIV融解曲线单重体系：50iil扩增体系内含有dNTP终浓度为IOmM;rTth酶 (东洋纺（上海）生物科技有限公司货号Tth-329)使用量为2. 5U;Mn(AcO)2终浓度为 2. 5mM;模板 20 ;HIV-F终浓度为 0? 7iiM，HIV-R终浓度为 0? 14iiM,HIV-Melt-P终浓度 为 0? 4yM;
[0076] (4)同时含有HCV实时荧光及HIV融解曲线的二重体系：50iil扩增体系内含有