dNTP终浓度为IOmM;rTth酶（东洋纺（上海）生物科技有限公司货号Tth-329)使用量 为2. 5U;Mn(AcO)2终浓度为2. 5mM;模板20ill;HCV-F终浓度为0. 7iiM，HCV-R终浓度为 0? 7UM,HCV-P终浓度为 0? 2UM，HIV-F终浓度为 0? 7UM，HIV-R终浓度为 0? 14Mm,HIV-P 终浓度为〇. 4iiM。
[0077] 1. 4:模板扩增
[0078] 分别用HCV实时荧光单重体系、HIV实时荧光单重体系、HIV融解曲线单重体系及 同时含有HIV融解曲线和HCV实时荧光的二重体系扩增各自对应的梯度模板E3、E2、El及 阴性模板，每个做2个重复，在BIO-RADCFX-96荧光定量PCR仪上扩增。扩增程序包括2 个部分，分别为1 :荧光实时扩增程序，95°C，Imin;6rC，20min;95°C，15s，64°C，30s，5个 循环（该5个循环，每个循环降1°C)，；95°C，15s，62°C，30s，40循环，其中在62°C处收集 荧光信号；2 :融解曲线程序，40°C升温到95°C，每秒钟升温0. 1°C，全程收集荧光信号。 [0079] 实验结果：
[0080] 具体实验结果请参见图1-图5。
[0081] 从图1可以看出，HCV单重实时荧光PCR利用扩增曲线可检测到El、E2、E3,而融 解曲线没有对应的融解峰；
[0082] 从图2可以看出，HIV单重实时荧光PCR利用扩增曲线可检测到El、E2、E3,其中 El仅检测出一个浓度，而融解曲线没有对应的融解峰；
[0083] 从图3可以看出，HIV单重融解曲线程序能够检测到El、E2、E3的融解峰，其中El 仅检测出一个浓度，而没有对应的扩增曲线；
[0084] 从图4可以看出，在同一体系中同时含有HCV实时荧光探针和HIV融解曲线探针， 能够分别检测到HCV的El、E2、E3和HIV的El、E2、E3;
[0085] 图5为三个反应体系在检测临床阴性样本时的融解曲线图，可以看出荧光强度依 次降低，但都无融解曲线峰。
[0086] 干扰性能结果分析：
[0087] (1)从实验结果图1和图2可以看出，HCV实时荧光单重体系和HIV实时荧光单重 体系只有扩增曲线，无融解曲线；从实验结果图3可以看出，HIV融解曲线单重体系只有融 解曲线，无扩增曲线。
[0088] (2)从实验结果图4可以看出，在同时含有HCV实时荧光探针及HIV融解曲线探针 体系内，既有扩增曲线，又有融解曲线。扩增曲线代表HCV、融解曲线代表HIV。
[0089] 综合以上两点表明，在同一反应体系内同时含有实时荧光探针及融解曲线探针的 情况下，二者之间不相互干扰。
[0090] 灵敏度结果分析
[0091] (1)从实验结果图1和图4中可以看出，通过比较HCV单重实时荧光探针扩增体系 和同时含有HCV实时荧光探针及HIV融解曲线探针的体系，HCV的检测灵敏度都能稳定检 测出E3、E2和El三个浓度。说明在多重PCR体系中，在含有融解曲线探针的情况下，不影 响正常实时荧光探针的灵敏度。
[0092] (2)从实验结果图2、图3、图4中可以可以看出，通过比较HIV单重实时荧光探针 扩增体系和同时含有HCV实时荧光探针及HIV融解曲线探针的体系，HIV的检测灵敏度一 致，能稳定检测出E3和E2二个浓度，但El浓度都各自检测出1个。说明在多重PCR体系 中，在含有实时荧光探针的情况下，不影响融解曲线的的灵敏度。
[0093] 特异性能分析
[0094] 从实验结果图5中可以看出，HIV实时荧光单重体系、同时含有HCV实时荧光探针 及HIV融解曲线探针二重体系和HIV融解曲线单重体系在检测阴性样本时荧光强度依次降 低，但都无融解曲线峰，可以明显的作为背景，判为阴性。这表明该探针融解曲线法具有良 好的特异性性能。
[0095] 结论：
[0096] 本发明建立了实时荧光PCR技术和融解曲线联合分析方法，能在同一反应体系内 既有扩增曲线又有融解曲线，且二者间不相互干扰，同时具有与实时荧光PCR法一样的灵 敏度及特异性。
[0097] 尽管本发明的【具体实施方式】已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根 据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保 护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
【主权项】
1. 基于探针法融解曲线技术进行多重核酸检测的探针，其特征在于，该探针不能被 DNA聚合酶水解，并且该探针与核酸结合的退火温度比同一反应体系中实时荧光探针与核 酸结合的退火温度低3-20°C。2. 权利要求1的探针，其中所述DNA聚合酶具有5' -3'外切酶活性。3. 权利要求1的探针，其5'端的五碳糖、碱基或者报告荧光基团被基团修饰，所述基团 例如为氣基、甲基、硫基、生物素等。4. 权利要求1的探针，所述探针与核酸结合的退火温度比同一反应体系中实时荧光 PCR中探针与核酸结合的退火温度低5-15°C。5. 权利要求1-4任一项的探针，所述探针的长度为10-40bp，例如为16-21bp。6. 基于探针法融解曲线技术进行多重核酸检测的反应体系，其包含权利要求1-5任一 项的探针。7. -种多重PCR反应体系，其包括基于实时突光PCR技术的反应体系以及权利要求6 的基于探针法融解曲线技术进行多重核酸检测的反应体系。8. 基于实时荧光PCR和探针法融解曲线技术相结合的多重核酸检测方法，所述检测方 法包括使用权利要求1-5任一项的探针、权利要求6或7的反应体系的步骤。9. 权利要求8的检测方法，所述方法包括以下步骤： (1) 在基于实时荧光PCR的基本反应体系中，另外加入一种或多种待测核酸样本，以及 与该待测核酸样本对应的一个或多个权利要求1-5任一项的探针； (2) 同时设定实时荧光PCR反应程序以及探针法融解曲线反应程序，所述融解曲线反 应程序的起始温度与权利要求1-5的探针的退火温度相比，低3-20°C，例如低5-15°C ; (3) 反应程序结束后，对得到的基于实时荧光PCR技术的扩增曲线和基于探针法融解 曲线技术的融解曲线进行分析。10. 权利要求9的检测方法，其中步骤（1)中所述的另外加入的核酸样本数或权利要求 1-5的探针的个数最多与同一反应体系中基于实时荧光PCR技术可检测的样本或探针数相 同。11. 权利要求9的检测方法，其中步骤⑴中的权利要求1-5任一项的探针还连接有报 告荧光基团，当该探针的数目为多个（例如为2、3、4、5个）时，这些探针之间的报告荧光基 团不同。12. 权利要求9的检测方法，其中步骤（1)中还加入与另外加入的核酸样本相适应的扩 增引物。13. 权利要求9的检测方法，其中所述的融解反应程序为，从比权利要求1-5任一项的 探针与核酸的退火温度低5-15°C开始，例如从40°C开始，逐渐升温至90-99°C，每秒钟升温 0. rc左右。14. 权利要求1-5任一项的探针、权利要求6或7的反应体系或权利要求8-13任一项 的检测方法用于检测核酸的用途。
【专利摘要】本发明属于生物技术领域，涉及多重核酸检测探针以及检测方法，具体涉及一种实时荧光PCR和探针法融解曲线技术相结合的多重核酸检测探针和检测方法。本发明还涉及所述探针或方法用于多重核酸检测的用途。本发明在基于实时荧光PCR技术的反应体系中增加了根据融解曲线反应程序设计的探针，并提供了相应检测方法，其在同一反应体系内可检测的样本数可达到基于实时荧光PCR技术可检测的样本数的两倍。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105087763
【申请号】CN201410206857
【发明人】叶祥忠, 吉尚志, 付军, 李益民
【申请人】北京万泰生物药业股份有限公司
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2014年5月16日